[发明专利]产红景天苷及其类似物的重组菌、构建方法及用途

说明书

本发明公开了一种产红景天苷及其类似物的重组菌、构建方法及用途，构建方法为：人工全合成酮基脱羧酶基因synkdc和糖基转移酶基因synyjic，将synkdc基因通过酶切，连接到表达载体pRSFDuet‑1的第一个启动子下游，筛选阳性克隆得到重组载体pSynkdc1；将synyjic基因连接到pSynkdc1的第二个启动子下游，筛选阳性克隆得到重组载体pSynkdc1‑yjic，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌；该重组菌以酪氨酸或葡萄糖为碳源，利用游离诱导表达和整合表达两种方法进行发酵生产红景天苷及其类似物。本发明可解决红景天苷及其类似物的来源问题，降低了成本，有利于工业化生产。

技术领域

本发明所属生物医药技术领域，涉及一种产红景天苷及其类似物的重组菌及构建方法。

背景技术

红景天苷(salidroside)是景天科(Crassulaceae)红景天属植物红景天(Rhodiola rosea)的主要有效成分，具有良好的抗氧化、抗辐射、抗疲劳、免疫调节、抗高原低氧等多种药理活性。其分子式为C₁₄H₂₀O₇，分子量为300.30，类白色或浅黄色粉末。近年来，研究发现红景天苷可用于癌症、神经系统疾病、细胞衰老、脑与心脏等器官缺氧与缺血、认知障碍、皮肤斑哺、代谢调节等多方面的治疗，因此使得红景天苷在药品、保健品、化妆品等工业生产中有广泛使用。

目前为止，红景天苷的主要来源依然是野生红景天，野生红景天中红景天苷的量很低,而且天然红景天苷的提取需要复杂的工艺，现在最常用的高山红景天和大花红景天，其植株中红景天苷的量只有0.5％-0.8％。而人工栽培的红景天成本颇高而有效成分量低。近几年，在化学合成、生物催化(酶催化)合成红景天苷等方面，相关理论和实践都取得了重要进步。尽管化学合成红景天苷及其类似物技术已日趋成熟，但大多都需要进行选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂。因此以上方法均不利于工业生产。

植物中红景天苷的生物合成分为4个阶段：第一阶段是初生代谢产物磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸经莽草酸途径形成莽草酸；第二阶段是由莽草酸再经几步酶促反应形成阿罗酸；第三阶段是由阿罗酸到酪醇的合成；第四阶段是由葡萄糖和酪醇结合形成红景天苷。在这4个阶段中，第l阶段是许多高等植物所共有的代谢步骤，是十分明确的，第2阶段和第4阶段的反应机制也已经被探索清楚；关于第3阶段，从阿罗酸到酪醇的生物合成途径，已经提出了3条可能的途径，即苯丙烷类代谢途径、酪氨酸脱羧代谢途径和酪氨酸转氨代谢途径。

近年来也已有研究证实酪氨酸可以经过脱羧、还原等步骤直接转化成酪醇。而红景天苷生物合成最后一步反应机制也已经明确，植物体内的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶以尿苷二磷酸葡萄糖和酪醇为底物催化合成红景天苷。因此，通过使用合成生物学技术，在工程微生物中构建全新的生物合成通路，有望实现红景天苷及其类似物的从头合成。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供产红景天苷及其类似物的重组菌。

本发明的第二个目的是提供产红景天苷及其类似物的重组菌的构建方法。

本发明的第三个目的是提供产红景天苷及其类似物的重组菌发酵制备红景天苷及其类似物的方法。

本发明的技术方案概述如下：

产红景天苷及其类似物的重组菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)人工全合成酮基脱羧酶基因synkdc，所述酮基脱羧酶基因synkdc的核苷酸序列如SEQ ID No.03所示；人工全合成糖基转移酶基因synyjic，所述糖基转移酶基因synyjic的核苷酸序列如SEQ ID No.04所示；

(2)按下述三种方式之一种进行：

方式一：