[发明专利]一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析试纸及其制备方法，属于免疫检测技术领域。

背景技术

支原体肺炎(mycoplasmal pneumonia，MP)是由肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)与宿主呼吸道粘膜上皮细胞的神经氨酸受体粘结，同时释放有毒代谢产物致病，引起的肺炎。MP起病缓慢，有发热、阵发性刺激性咳嗽，少量黏液性或黏液脓性痰(偶有血痰)，肺部体征多不明显，但易引起肺外多系统受累，也可威胁生命或死亡。MP好发于儿童或青少年，血清流行病学研究显示我国社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)患者中20.7％-38.9％由MP引起，居成人社区获得性肺炎病原体的首位。MP除导致呼吸道症状外，20％-25％的病例可出现脑膜炎、心肌炎、溶血性贫血、血小板减少性紫癜等肺外表现。及时有效的诊断可有效控制MP感染病情的加重，降低死亡率。

肺炎支原体的诊断方法主要依靠分离培养和血清学试验。血清学检测在MP感染实验室诊断中占重要地位，以被动凝集法、免疫层析试验(immunochromatography assay,ICA)和酶联免疫分析法(Enzyme immunoassay，ELISA)应用最为广泛。被动凝集法主要检测混合的MP-IgM和MP-IgG，可以半定量；相较于凝集法，ELISA的优势是可以分型检测特异性IgM、IgG等抗体，而这些亚型与感染的病程相关。MP-IgM阳性可作为早期或急性感染的诊断指标。一般在感染约7天后可被检测到，10-30天后达到峰值，76.5％的患者2周后降到无法检测到的程度。MP-IgG常发病2周后出现，是MP感染最可靠的指标。双份血清4倍以上滴度上升提示近期感染，否则为既往感染。虽然单次测定MP-IgM阳性即可判定为MP新近感染，但是阴性却不能排除感染。因此临床强调配对同时检测MP-IgM和MP--IgG对评价MP感染状况更有意义，同时也强调了对微量、更加快速、准确可靠、高灵敏、宽量程的定量诊断技术的需求。

免疫层析试验(immunochromatography assay，ICA)是一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗原(或抗体)先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，在硝酸纤维素膜的一端加入样品后，由于毛细管虹吸作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗原(或抗体)的区域时，样品中相应的抗体(或抗原)即与该抗原(或抗体)发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。ICA的特点是可进行单份标本检测、简便、快速(5-15分钟可出结果)、标本用量少、不需任何仪器设备，因此，发展非常迅速。但存在敏感度略低、精密度较差、质控困难、不易制备定量试剂等缺点。时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是一种以镧系元素螯合物为标记物的新兴技术，具有零本底、线性范围宽、稳定性好等特点，灵敏度可达到10^-18mol/L，较ELISA、CLIA、ECLIA等的10^-9-10^-15mol/L更高，非常符合超微量检测对灵敏度的要求。但TRFIA完成一次测试需要3个小时左右，需洗板机等其它设备，一般适用于大批量检测，在单份测定时存在操作复杂、费时、仪器要求高等不足。将镧系元素包裹到合适的纳米微球内形成时间分辨荧光微球(不需加解离增强溶液，即可在紫外光的激发下发出高强度的荧光信号)，把高灵敏的TRFIA技术与方便的免疫层析试验相结合，建立一种时间分辨荧光免疫层析分析。镧系元素的检测窗口和检测波长不一样，可进行多标记分析。采用包裹Eu³⁺和Sm³⁺的纳米微球可以建立双标记纳米时间分辨荧光免疫层析方法。

本发明提供了一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析方法，在一个免疫层析板上同时进行MP-IgM和MP-IgG定量检测，为临床提供一种新的方便、快速、灵敏度高、定量、可用末梢血的检测技术。

发明内容

本发明的目的是克服现有肺炎支原体抗体检测方法如免疫层析试验(ICA)和酶联免疫分析法(ELISA)技术等仅能定性或半定量检测，且进行MP-IgM和MP-IgG检测必须进行2次实验等存在的不足，提供一种肺炎支原体抗体(MP-IgM和MP-IgG)双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸及其制备方法。