[发明专利]一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸及其制备方法

权利要求书

1.一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸，其特征是：包括粘性底层（1）、样品垫（2）、结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）和吸水纸（5）；

所述粘性底层（1）上依次设置样品垫（2）、结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）和吸水纸（5）；

其中硝酸纤维素膜（4）直接设置于粘性底层（1）上，结合垫（3）的后端搭接在硝酸纤维素膜（4）前端上，样品垫（2）的后端搭接在结合垫（3）的前端上，样品垫（2）的前端直接粘结在粘性底层（1）上；所述吸水纸（5）的前端搭接在硝酸纤维素膜（4）的后端上；其中硝酸纤维素膜（4）上设有检测带（T）和质控带（C）;

所述质控带（C）和检测带（T）平行设置，两者之间相距0.5-0.6cm；检测带（T）与结合垫（3）之间的距离为0.5-0.6cm;

所述检测带（T）由肺炎支原体抗原涂层形成；质控带（C）由兔抗鼠多克隆抗体涂层形成;

所述结合垫（3）表面喷涂有鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体；所述鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体分别偶联有2种不同的镧系稀土离子的纳米微球;

所述镧系稀土离子为铕离子Eu³⁺和钐离子Sm³⁺。

2.如权利要求1所述的肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸，其特征是：所述纳米微球的直径为10-500nm。

3.如权利要求1所述的肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸，其特征是：所述吸水纸（5）与硝酸纤维素膜（4）相重叠的部分在粘性底层（1）长度方向的长度为2mm，且重叠部分中吸水纸（5）位于硝酸纤维素膜（4）的上方；

所述结合垫（3）与硝酸纤维素膜（4）相重叠的部分在粘性底层（1）长度方向的长度为2mm，且重叠部分中结合垫（3）位于硝酸纤维素膜（4）的上方；

所述样品垫（2）与结合垫（3）相重叠的部分在粘性底层（1）长度方向的长度为2mm，且重叠部分中样品垫（2）位于结合垫（3）的上方，结合垫（3）直接与底板（1）相接触部分的长度大于4mm。

4.权利要求1-3之一所述的肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸条的制备方法，其特征是包括如下步骤：

（1）原材料准备：准备符合要求的粘性底层（1）、样品垫（2）、结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）和吸水纸（5）；

（2）抗体的预处理：用0 .05mol/L，pH为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液在4℃下用10kDa的膜分

别透析鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体，过夜，得到预处理后的抗体；

（3）标记鼠抗人IgG抗体的包裹铕离子的纳米微球的制备：取包裹铕离子的纳米微球，用蒸馏水配置成质量浓度为1%的纳米微球溶液；取纳米微球溶液250μL，向其中加入碳二亚胺和步骤（2）预处理过的鼠抗人IgG抗体，碳二亚胺的终浓度为19.5-20.5mmol/L，纳米微球

与鼠抗人IgG抗体的质量比为50:1；室温反应2小时，14000r/min离心，去除上清液后，加入

质量浓度为1%的BSA溶液，至BSA终浓度为0 .05 mol/L，用pH为7.15-7.25的磷酸盐缓冲液至纳米微球浓度为0.99-1.01μg/L，待用；

（4）标记鼠抗人IgM抗体的包裹钐离子的纳米微球的制备：取包裹钐离子的纳米微球，用蒸馏水配置成质量浓度为1%的纳米微球溶液；取纳米微球溶液250μL，向其中入碳二亚胺和步骤（2）预处理过的鼠抗人IgM抗体，碳二亚胺的终浓度为19.5-20.5mmol/L，纳米微球

与鼠抗人IgM抗体的质量比为50:1，室温反应2h，14000r/min离心，去除上清液后，加入质量

浓度为1%的BSA溶液，至BSA终浓度为0.05mol/L，pH为7.15-7.25的磷酸盐缓冲液至纳米微球微球浓度为0.99-1.01μg/L，待用；

（5）结合垫的制备：将步骤（3）制备纳米微球溶液与步骤（4）制备的纳米微球溶液按照质量比1：1混合，得到混合纳米微球溶液；用定量喷膜仪以3-5μL/cm的量将混合微球溶液喷涂于聚酯膜形成的结合垫（3）上，避光的条件下于35-38℃烘干1小时，加入硅胶干燥剂封存备用；

（6）硝酸纤维素膜的制备：使用0 .02mol/L，pH为7.35-7.45的、含质量浓度1%蔗糖的磷酸盐缓冲液，分别用10kDa的膜透析肺炎支原体抗原和兔抗鼠多克隆抗体，然后分别将两者的浓度最终稀释到1μg/L，使用定量喷膜仪以1μL/cm的量将二者喷于硝酸纤维素膜（4）上，得到依次设置的肺炎支原体抗原检测带（T）和兔抗鼠多克隆抗体质控带（C），35-38℃烘干1h，加入硅胶干燥剂封存备用；

（7）样品垫的制备：使用含质量浓度为1% BSA、0.1% Triton100的0.02M pH7.35-7.45的磷酸盐缓冲液浸泡样品垫1h后，35-38℃烘干3小时；

（8）免疫层析膜条的组装：将上述步骤所制得的样品垫（2）、结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）、吸水纸（5）依次组装在粘性底层（1）上，即得到产品肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析试纸。