[发明专利]一种尿液外泌体分离、富集及检测的集成检测方法及检测芯片

说明书

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及开发一种集成尿液外泌体分离、富集及ELISA检测的微流体芯片。

背景技术

膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位。检查方法包括尿常规检查、尿脱落细胞学、尿肿瘤标记物、腹部和盆腔B超等检查。根据上述检查结果决定是否行膀胱镜、静脉尿路造影、盆腔CT或/和盆腔MRI等检查明确诊断。其中，膀胱镜检查是诊断膀胱癌的最主要方法。然而膀胱镜检测费用高，并不适用于基层医疗单位或者贫困地区的普及应用，临床上亟待寻找一种针对膀胱癌检测的生物标志物来进行检测。外泌体（exosomes）是一种直径约为40-120nm，具有双层质膜结构的囊泡，由细胞通过胞吐作用释放至细胞外隙或生物学体液中。近年来，外泌体成为新的研究热点，因其内包含来源细胞所特有的mRNAs、microRNAs及蛋白等多种信号分子，在信号传导和免疫系统中起重要作用，并由完整的膜性结构包裹而减少微环境干扰，这使其在疾病诊断方面具有独特的优越性，是研究生物标志物和进行肿瘤免疫的新的生物材料，同时也具有治疗潜力。

目前针对外泌体的研究主要分为分离技术和检测技术。分离技术包括超速离心法、过滤离心法、密度梯度超速离心法、免疫磁珠结合超速离心法和色谱法等。检测技术主要包括：扫描电子显微镜观察形态（但SEM对样品的预处理和制备上面要求较高，样品的准备阶段比较复杂，不适合对外泌体进行大量快速的测量，而且由于外泌体经过了预处理和制备过程，无法准确的进行外泌体浓度的测量）、动态光散射技术（但由于动态光散射技术是测量光强的波动数据，所以大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号，所以动态光散射不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量，只适合通过色谱法制备的大小均一的外泌体的尺寸测量，并且无法测量样品中外泌体的浓度。）、流式细胞仪检测技术（流式细胞仪不仅可以检测囊泡的大小、数量，而且通过荧光标记可以检测囊泡的来源，将囊泡进行分类，因此，流式细胞仪是进行囊泡快速、高通量、多参数检测的最优选择。然而，传统流式细胞仪针对的样本主要是细胞，散射光的检测极限通常是300-500nm，而大多数细胞外囊泡的直径都在300nm以下，因此很难进行精确地定量和定性分析。）、纳米微粒追踪分析技术（是一种比较新颖的研究纳米颗粒的方法，可以直接和实时的观测纳米颗粒。由于外泌体表面有标志物CD9、CD63等跨膜分子的存在，在复杂的背景环境下(如血清中)，可以用荧光抗体标记外泌体，再用NTA的荧光测量功能实现在复杂背景下对外泌体的测量，但是需要精密的仪器）、流式细胞仪分析技术（但是流式细胞分析一次只能针对一个标志物进行检测，外泌体太小，由目前的流式细胞仪设备检测，有必要先绑定外来抗体包被的磁珠，需要精密的仪器设备，且操作繁琐、敏感度各异）、免疫印迹检测技术（操作过程复杂）和荧光定量PCR检测分析microRNA（提取核酸步骤复杂，需要昂贵的实验仪器）。因此，发展一种能够可靠、快速、经济地无创检测外泌体尤其是膀胱癌患者来源的外泌体的方法非常必要。微流体芯片微流体芯片实验室，是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。是生命科学、化学科学与信息科学信号检测和处理方法研究的重要技术平台。具有集成性、分析速度快、高通量、能耗少、污染小、廉价、安全等特点。因此，构建一种集成外泌体分离、富集、检测为一体的微流体芯片，拥有巨大的经济效益。

外泌体在尿液中可以稳定存在，尤其是尿液样品可以在非创伤性损伤的前提下大量获得。因此，如果能够检测尿液外泌体中的癌症信息，则有望将其用于癌症的无创诊断、监控等临床应用。然而，实际上，由于单位体积尿液中的外泌体含量非常低，采用一般方法单次提取得到的外泌体，根本无法满足后续检测的要求，所以目前针对外泌体的检测主要是先对样本中的外泌体进行浓缩处理，之后再采取一定的表征测量。因此，本发明针对上述问题，研制了一种集成外泌体分离、富集和检测为一体的微流体芯片，同时利用外泌体跨膜蛋白CD63这一特有的标志物，建立了一种芯片ELISA快速诊断方法。该方法在膀胱癌患者外泌体检测、监测等方面具有一定的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种外泌体分离、富集和检测的集成检测方法，该方法为外泌体芯片ELISA检测方法，可有效检测膀胱癌患者体内外泌体的量，检测结果特异性强，实用性强。