[发明专利]一种尿液外泌体分离、富集及检测的集成检测方法及检测芯片

权利要求书

1.一种非诊断目的的尿液外泌体分离、富集及检测的集成检测方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

1)设计和组装双膜过滤芯片：所述双膜过滤芯片为四层PMMA板，相邻两层PMMA板之间用双面胶DSA连接，中间两层PMMA板上分别切割有上下位置一致的进液孔和废液排出孔，最上层的PMMA板上切割有分别与进液孔和废液排出孔对应的注液孔和排液孔，所述注液孔和排液孔上分别连接软管，最底层为PMMA平板，中间两层PMMA板之间设有两层DSA胶，这两层DSA胶之间粘附有孔径分别为200nm和30nm的聚碳酸酯膜，用于液体的过滤和外泌体的收集；

2)构建芯片ELISA检测标准曲线：

①收集并去除细胞及其碎片，将上清液超离后用PBS重悬外泌体沉淀，

②将①所得外泌体悬液，按照不同比例进行稀释，之后分别取一定量的外泌体悬液原液和稀释液用微流注射泵注入到步骤1)的双膜过滤芯片中，

③之后，每个双膜过滤芯片继续注入生物素标记的anti-CD63，以1:200-1:500稀释，其浓度为2-5μg/mL，后进行孵育，

④用PBS缓冲液进行清洗双膜过滤芯片，清洗结束后向每个双膜过滤芯片内注入一定量的空气来排尽双膜过滤芯片内液体，

⑤向每个双膜过滤芯片注入300μL链霉亲合素标记的HRP，以1:2000-1:5000稀释，其浓度为0.2-0.5μg/mL，并于湿盒孵育，

⑥向每个双膜过滤芯片注入TMB显色液，并于暗室中显色，

⑦用成像系统进行数据采集，

⑧对采集数据进行处理分析，从而构建标准曲线；

3)样本收集、注样和清洗：收集尿液样本，室温离心并去除细胞及其残片，将上清液用微流注射泵连续注入双膜过滤芯片中，后用pH7.4的PBS以一定流速注入到双膜过滤芯片中，重复数次，完成样本的清洗；

4)芯片ELISA检测：采用步骤2)的③-⑧，对步骤3)所捕获的外泌体进行检测；

5)数据处理分析：将检测结果代入标准曲线，进行外泌体浓度的比对。

2.如权利要求l所述的一种非诊断目的的尿液外泌体分离、富集及检测的集成检测方法，其特征在于，将液体注入到双膜过滤芯片中时，液体的进样速度范围为30-60μL/min，用微流注射泵进行样本注入。

3.如权利要求l所述的一种非诊断目的的尿液外泌体分离、富集及检测的集成检测方法，其特征在于，所述样本清洗中采用的洗涤液为磷酸盐缓冲液PBS，其pH为7.4，洗涤次数为2-4次。

4.如权利要求l所述的一种非诊断目的的尿液外泌体分离、富集及检测的集成检测方法，其特征在于，在向双膜过滤芯片中加样时，每个样本重复2-3次，每孔300μL。

5.如权利要求l所述的一种非诊断目的的尿液外泌体分离、富集及检测的集成检测方法，其特征在于，加完样的双膜过滤芯片在进行湿盒孵育时的静置反应为生物素和链霉亲合素结合，其反应温度为35-37℃，时间为1-2小时。

6.如权利要求l所述的一种非诊断目的的尿液外泌体分离、富集及检测的集成检测方法，其特征在于，所述的显色液为四甲基联苯胺(TMB)，显色反应为HRP和TMB反应，显色反应时间为5-30分钟，反应温度为35-37℃。