[发明专利]一种免疫磁性纳米微粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种免疫磁性纳米微粒的制备方法。

背景技术

四氧化三铁纳米微粒具有良好的生物相容性和磁学性能，其在外加磁场作用下，可迅速聚集并与其它组分分离，使其在细胞分选和标记，蛋白质分离纯化，药物输送，磁共振造影、细胞标记、靶向药物载体等方面得到广泛应用；然而，未经表面修饰处理的四氧化三铁纳米微粒在溶液中由于其粒径小，表面活化能大，颗粒间静磁与电偶矩相互作用，导致其稳定性很差，容易团聚，产生沉积，同时还容易被氧化。因此需要对其进行修饰，改变其表面性质，防止其被氧化并能够更好地分散在水相中。同时其表面经修饰的高密度活性基团能够与生物分子、细胞表面以及其它活性分子进行偶联以满足不同的应用。

目前已经有多种四氧化三铁纳米微粒的制备、表面修饰以及偶联生物分子的方法。公开号分别为CNI01241130A、CN1667413A的发明专利为包覆聚苯乙烯等有机高分子聚合物的结构，公开号分别为CNI015196482B和CN1872028A的发明专利是通过修饰和活化羧基制备出免疫磁性微粒。公开号为CN 103357359 A利用Schiff反应生成亚胺来偶联磁纳米微粒与生物活性分子，公开号为CN 102766191 B是通过在磁微粒表面多次修饰与基团保护从而与蛋白质偶联。目前这些磁微粒的制备技术存在的问题是工艺条件要求较高、制备过程繁琐、涉及有机毒性物质、需要大型仪器设备、批间重复性差、难以大量稳定制备、生物活性分子偶联效率低、容易脱落等，因此在工业化应用上受到较大限制。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术工艺条件要求较高、制备过程繁琐、涉及有机毒性物质、难以大量稳定制备、偶联效率低、稳定性差、易脱落等技术瓶颈，从而提出一种偶联效率高、粒径均匀、稳定性好、工艺简单、周期短、低毒、低成本、无需大型设备的免疫磁性纳米微粒的制备工艺。

为解决上述技术问题，本发明公开了一种免疫磁性纳米微粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

a.制备四氧化三铁纳米微粒内核

配制二价铁盐溶液，然后加至含柠檬酸钠以及高浓度硝酸盐的碱性溶液中搅拌；然后进行沉淀离心分离，得到磁悬浮液；

b.制备表面硅包覆的纳米磁微粒

用步骤a制备的纳米磁微粒，磁性分离，用碱液洗涤悬液，重分散于碱液中；将正硅酸乙酯溶解于乙醇中，并加入至分散液中，搅拌，在磁微粒表面生成的一层二氧化硅得到的包覆，磁分离得到表面硅包覆的磁微粒；

c.制备表面羧基修饰的磁微粒

称取氨基化硅烷与酸酐，在无水溶剂中搅拌，得到羧基化硅烷；将羧基化硅烷溶解于无水乙醇中，加入纳米磁微粒，加碱液，并搅拌，然后用无水乙醇与纯化水洗涤，磁分离，得到表面羧基修饰的纳米磁微粒；

d.制备免疫磁微粒

将步骤c制备的羧基磁微粒洗涤分散于缓冲液中，用Sulfo-NHS与EDC活化反应后，磁分离，加入抗原、抗体或其它生物活性分子，振荡反应，磁分离即得免疫磁性纳米微粒。

优选的，所述方法步骤如下：

a.制备四氧化三铁纳米微粒内核

配制二价铁盐溶液，加至剧烈搅拌的含柠檬酸钠以及高浓度硝酸盐的碱性溶液中，在25～90℃条件下搅拌5分钟以上，得到稳定的磁悬浮液；

b.制备表面硅包覆的纳米磁微粒

用步骤a制备的纳米磁微粒，磁性分离，用pH值为10～13的碱液洗涤悬液3次，重分散于碱液中，调节pH值为10～13，将正硅酸乙酯溶解于乙醇中，并按比例加入至分散液中，30～50℃条件下混合物搅拌4～5小时，在磁微粒表面生成的一层二氧化硅得到的包覆；磁分离得到表面硅包覆的磁微粒；

c.制备表面羧基修饰的磁微粒

按酸酐基团与氨基摩尔比(1.2～2):1将称取氨基化硅烷与酸酐在无水溶剂中搅拌10到60分钟，得到羧基化硅烷。将羧基化硅烷溶解于无水乙醇中，加入1.2制备的纳米磁微粒，用碱液调节pH值至10～13，30～50℃搅拌4～5小时，然后用无水乙醇与纯化水洗涤，磁分离，得到表面羧基修饰的纳米磁微粒；

d.制备免疫磁微粒

优选的，将步骤c制备的羧基磁微粒用pH值为6.0～7.0的MES缓冲液洗涤三次，再分散于此缓冲液中，用Sulfo-NHS与EDC在室温下活化振荡反应0.5～1小时后，磁分离，洗涤除去未反应的试剂，加入抗原、抗体、链霉亲和素分子，室温振荡反应3h，磁分离，缓冲液洗涤后即得。