[发明专利]一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法

说明书

技术领域

本发明涉及霍山石斛技术领域，尤其涉及一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法。

背景技术

霍山石斛生物碱类是霍山石斛的主要成分之一，生物碱的药理作用主要表现在抗肿瘤、对心血管、胃肠道抑制作用及止痛退热等作用。随着社会发展，人们对健康的关注越来越高，其需求量也会越来越大，但传统霍山石斛生物碱类的提取方法是用霍山石斛的根、茎、叶等植物体提取所得，这种工艺所得的产品已经不能满足未来市场对霍山石斛精深加工的需求。

随着植物细胞工程技术的发展，用细胞进行人工培养扩增提取植物的代谢产物，可以不受土地面积、气候环境、地域、病虫害等限制影响，适于工业化生产。利用细胞工程技术生产石斛生物碱类的技术，在国内外早有研究，也取得了诸多成果，但在生产过程中存在很多难题问题，如工艺复杂、生物量增速低、目标产物收率低、生产周期长等。关于利用气升搅拌罐悬浮培养霍山石斛细胞生产霍山石斛生物碱的研究还没有报道，因此开发一种高效生产霍山石斛中生物碱类天然产物的方法是十分有意义的。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种工艺简单、稳定，适合工业化生产悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法。

本发明通过以下技术手段去解决上述技术问题的：一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，包括以下步骤：

(1)单细胞制备：取霍山石斛蒴果消毒后用固体培养基进行无菌播种，待萌发成原球茎后取出，采用酶解法分离制备单细胞，并离心过滤除杂，收集单细胞；

(2)单细胞系培养：将收集到的单细胞接种到第一MS液体培养基中培养；

(3)细胞群放大培养：将培养好的单细胞系接种于第二MS液体培养基中培养；所述第二MS液体培养基中的P元素含量为MS液体培养基的2-3倍，所述第二MS液体培养基中还添加有1-2mg/L的锗元素、0.02-0.1mg/L硒元素和0.1-0.2g/L的酸水解酪蛋白，pH值为5.8±0.4。

使用本发明的第二MS液体培养基，相对于MS液体培养基能延长分批培养细胞生长时间2倍以上，提高细胞密度2倍以上。锗元素、硒元素、酸水解酪蛋白能够显著增加霍山石斛悬浮细胞的鲜重、提高蛋白质和叶绿素的含量,使细胞抗氧化活性明显升高。

(4)提取霍山石斛生物碱：当细胞密度达到60000-80000个/ml，降低培养温度至7-10℃，继续培养5-7天，采用离心收集霍山石斛细胞；再提取霍山石斛生物碱。

由于生物碱是次级代谢产物，与细胞生长不偶联，降低培养温度至该温度范围内，使细胞不增长，能促使生物碱产物的产生。

优选地，所述步骤(1)播种采用的培养基为适合兰科植物生长的固体培养基。

优选地，所述固体培养基为1/2MS培养基。1/2MS培养基中大量元素减半，适合兰科植物种子萌发。

优选地，所述步骤(2)中单细胞接种量为25±2g/L，光强度为2000-4000lux，色温为4000-6000K，震荡培养，温度22±2℃，当细胞密度达到10000-20000个/mL，即可放大培养。该光强度范围有助于细胞的形态建成和活力提升，过高则浪费，过低则达不到效果。该色温为暖光，蓝紫光较为均衡，有利于代谢产物的合成。该温度范围为霍山石斛生长和代谢最为均衡的温度。该密度下，细胞的群体生长处于指对数时期，即活力最旺盛的时期。

优选地，所述步骤(3)中单细胞系接种量为30±2g/L，光强度为2000-4000lux，色温为4000-6000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30％。

优选地，所述第二MS液体培养基中还添加有0.1-2mg/L NAA、0.1-2mg/L 6-BA、50-100mg/L果胶酶、10-50mg/L纤维素酶，pH值为5.8±0.4。添加植物生长调节剂和生物酶制剂到培养基中，能激活细胞分裂生长，并防止细胞聚集结块，保证营养和溶氧和二氧化碳供应均匀、充分。

优选地，所述锗元素来源于GeO₂或有机锗。

优选地，所述硒元素来源于N_a2SeO₃或有机硒。