[发明专利]一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法

权利要求书

1.一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)单细胞制备：取霍山石斛蒴果消毒后用固体培养基进行无菌播种，待萌发成原球茎后取出，采用酶解法分离制备单细胞，并离心过滤除杂，收集单细胞；

(2)单细胞系培养：将收集到的单细胞接种到第一MS液体培养基中培养；

(3)细胞群放大培养：将培养好的单细胞系按照接种量为30±2g/L接种于第二MS液体培养基中培养，培养条件为：光强度2000-4000lux，色温4000-6000K，温度22±2℃，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30％；所述第二MS液体培养基中的磷元素含量为MS液体培养基的2-3倍，所述第二MS液体培养基中还添加有1-2mg/L的锗元素、0.02-0.1mg/L硒元素、0.1-0.2g/L的酸水解酪蛋白、0.1-2mg/L NAA、0.1-2mg/L 6-BA、50-100mg/L果胶酶、10-50mg/L纤维素酶，pH值为5.8±0.4；

(4)提取霍山石斛生物碱：当细胞密度达到60000-80000个/ml，降低培养温度至7-10℃，继续培养5-7天，采用离心收集霍山石斛细胞；再提取霍山石斛生物碱。

2.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，所述步骤(1)播种采用的培养基为适合兰科植物生长的固体培养基。

3.根据权利要求2所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，所述固体培养基为1/2MS固体培养基。

4.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，所述步骤(2)中单细胞接种量为25±2g/L，光强度为2000-4000lux，色温为4000-6000K，震荡培养，温度22±2℃，当细胞密度达到10000-20000个/mL，即可放大培养。

5.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，所述锗元素来源于GeO₂或有机锗。

6.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，所述硒元素来源于Na₂SeO₃或有机硒。