[发明专利]一种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应用，特别涉及一种巨型鱿鱼软骨来源天然新型高硫酸化硫酸软骨素的制备及其在抗肿瘤方面的应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

硫酸软骨素(简称CS)是一种酸性黏多糖，广泛存在于牛骨、猪骨、鸡骨、鲨鱼骨、鱿鱼骨中，属于糖胺聚糖的一种，是一种天然来源的生物大分子。其基本组成单位是D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖通过β-1,3糖苷键连结而成的二糖(→4GlcUaβ1→3GalNAcβ1→)^[1]。自然界中大多数的CS是以N-乙酰-D-氨基半乳糖的4位或6位发生硫酸化的形式存在的，我们分别称之为CS-A、CS-C。除了CS-A、CS-C外，根据D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖硫酸化模式不同还存在包括CS-O、CS-E、CS-D、CS-K等在内的多种异构体^[2]。CS-A、CS-C、CS-O、CS-E的结构式如下所示：

值得一提的是CS-E是硫酸软骨素中的重要一员，其富含N-乙酰-D-氨基半乳糖C-4位和C-6位发生硫酸化的高硫酸化二糖单位(E-unit)，使其带有大量负电荷，形成特定的分子结构。这种特性更利于其与细胞因子、生长因子、趋化因子、细胞粘附分子、脂蛋白特异性结合，进而调节神经生长、生长因子信号转导、创伤愈合、感染、肿瘤细胞迁移以及肿瘤细胞增值等生理或病理过程^[3]。从而在抗肿瘤细胞转移、促进神经突触生长、刺激软骨细胞合成II型胶原中发挥关键作用，对癌症、关节炎、神经痛等疾病有很好的预防、辅助治疗作用^[4]。

癌症是导致全球死亡率的一个重要原因。癌症之所以是人类久攻不下的难题，与其自身的病症特性有很大的关系，其中最为棘手的是癌细胞可不断迁移并侵入正常组织形成新的转移灶。研究发现在这一过程中肿瘤细胞硫酸软骨素的含量、组成、分子大小及分子结构与相应的正常组织有明显差异。而这种差异是肿瘤细胞迁移、侵入正常组织的先决条件。所以根据肿瘤细胞的这一特性，硫酸软骨素的抗肿瘤研究已经成为国内外研究的热点。深入研究发现硫酸软骨素抗肿瘤活性对硫酸软骨素硫酸化模式、分子量等都有严格要求，其中E-unit的含量最为关键。商品化的CS-E的E-unit含量在60％左右，硫酸化度约1.5，分子量范围为50～140kDa，但是其价格昂贵，且生产工艺主要集中于日本。国内关于提取富含E-unit的硫酸软骨素的研究文献寥寥无几，仅有的报道中制备出的CS硫酸化度仅有0.5左右^[5-7]。最重要的是制备这种CS-E的原料来自一种名为太平洋褶皱鱼(Todarodes Pacificus)的小型鱿鱼，但是Todarodes Pacificus软骨含量很少无法形成大量生产，并且近年来随着海洋污染加剧Todarodes Pacificus渔获量逐年递减，价格上升。

中国专利文献CN1563098A(申请号200410006223.5)公开了一种制备硫酸软骨素的方法，该方法包括以下步骤：A.将卡拉胶分解为分子量为1-4万，优选2-3万的卡拉胶寡糖；B.将鱿鱼骨用15％到饱和的强碱液处理，然后用酸中和，收集胶体；C.将步骤A制得的卡拉胶寡糖、步骤B制得的胶体和氨基葡萄糖在酸性条件下反应，再纯化，获得硫酸软骨素。该方法采用强碱处理，从而导致获得的硫酸软骨素的硫酸化程度较低，而且引入的卡拉胶，不利于硫酸软骨素的纯化，导致硫酸软骨素纯度低，相关应用价值大幅下降。

因此寻找富含E-unit硫酸软骨素的新原料，不仅可以缓解太平洋褶皱鱼的生存压力更能拓宽富含E-unit硫酸软骨素原料来源。研究发现不同种属动物体内所存在的硫酸软骨素亚型的含量、种类各不相同，同一动物因年龄、组织部位的不同硫酸软骨素的种类、含量也在不断变化。这一发现为制备不同种类的硫酸软骨素提供了很好的理论基础。一般来说，在牛的喉骨、鸡软骨、鲸鱼软骨中CS-A含量最高，可达76.2-90％；鲨鱼翅软骨中CS-D的含量最为丰富，而在其它鲨鱼软骨中CS-C含量最高，可达72.9％；鱿鱼软骨来源CS中E-unit含量最高，可达60％。

美洲大赤鱿(Dosidicus Gigas)生长周期短、产量大、价格便宜，而软骨骨质硬无法食用，一般作为废料丢弃。对美洲大赤鱿的软骨进行研究利用，目前还未有相关报道。

发明内容