[发明专利]一种高硫酸化硫酸软骨素及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种高硫酸化硫酸软骨素，其特征在于，分子量为100～800KDa，硫酸化度在0.7～1.43，二糖组成如下，均为质量百分比：

O-unit 3.9～10%；

C-unit 11.8～35%；

A-unit 30～37.7%；

E-unit 19～46.6%。

2.如权利要求1所述的高硫酸化硫酸软骨素，其特征在于，所述高硫酸化硫酸软骨素分子量为623.2KDa，硫酸化度在1.43，二糖组成如下，均为质量百分比：

O-unit 3.9%；

C-unit 11.8%；

A-unit 37.7%；

E-unit 46.6%。

3.权利要求1或2所述高硫酸化硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将美洲大赤鱿（Dosidicus Gigas）软骨粉碎后加入有机溶剂进行脱水脱脂，干燥，制得脱脂软骨；

（2）向步骤（1）制得的脱脂软骨中加水浸没处理，固液分离，向沉淀中加入酶反应缓冲液，混合均匀，调pH 5.0～9.0，加入蛋白酶在40～70 ℃酶解反应24～96 h，灭活酶，固液分离，取液体，制得酶解粗液；

所述蛋白酶为黑曲霉蛋白酶或者黑曲霉蛋白酶与其他蛋白酶的混合；蛋白酶的加入量为脱脂软骨干重的1‰～5‰，黑曲霉蛋白酶占蛋白酶的质量百分含量为20～100%；

（3）将步骤（2）制得的酶解粗液经除蛋白后，调pH至7.0～10.0，然后加入酶解粗液质量百分比1～10%的NaAc 固体，溶解，加入乙醇使体系中乙醇的体积终浓度达到50%～85%，固液分离，取沉淀，制得初级多糖；

（4）将步骤（3）制得的初级多糖溶解于水中，经阴离子交换树脂纯化，以0～2.5M 氯化钠溶液浓度梯度洗脱，收集洗脱峰，醇沉，固液分离，超滤，干燥，制得高硫酸化硫酸软骨素。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，有机溶剂为丙酮或无水乙醇，有机溶剂的加入量为沉淀体积的2～4倍；脱水脱脂的时间为4～24 h，次数为2～4次。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，处理条件为：在60～100 ℃处理10～30 min。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，酶反应缓冲液为氯化钙硼酸缓冲液，氯化钙浓度为5～10 mM，硼酸浓度为50～100 mM，pH7.0～9.0。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，其他蛋白酶为链霉蛋白酶E、木瓜蛋白酶和/或胰蛋白酶。

8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，酶解反应过程中，还包括两次蛋白酶补加步骤，每次补加量均为上次加酶量的0.4～0.6倍，第一次补加时间为酶解反应6～24 h后，第二次补加时间为酶解反应12～48 h后。

9.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，灭酶活条件为沸水浴中静置5～20 min。

10.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述固液分离均为离心，条件为5000～10000 rpm离心5～20 min。

11.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，除蛋白的具体步骤如下：

按步骤（2）制得的酶解粗液体积的2～10%加入三氯乙酸（TCA），离心，取上清液，加入乙醚抽提三氯乙酸，去除乙醚。

12.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，阴离子交换树脂纯化的具体条件为初级多糖溶解于水中，浓度为10 mg/ml，加入硫酸软骨素溶液重量40～80%的阴离子交换树脂室温孵育0.5～2 h，以0～2.5M 氯化钠溶液浓度梯度洗脱分别洗脱3倍柱体积，收集洗脱峰。

13.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，醇沉的乙醇体积浓度为50%～85%；超滤膜的截留分子量为10 kDa以上；干燥温度为不超过80℃。

14.权利要求1或2所述高硫酸化硫酸软骨素在制备抗肿瘤药物中的应用。