[发明专利]刺槐类枯草杆菌蛋白酶基因、其编码蛋白、其克隆引物及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种遗传工程的RNA的分离、制备、纯化和应用，特别涉及一种编码植物蛋白质的基因的分离、制备纯化和应用，属于分子生物学的遗传工程领域。

背景技术

枯草杆菌蛋白酶是一类催化活性依赖于丝氨酸残基的蛋白水解酶，该酶参与生物发育的很多过程：种子萌发、胁迫相应、果实成熟、器官衰老、果实成熟、细胞凋亡及细胞程序性死亡等过程。类枯草杆菌蛋白酶类有200多个不同的家族成员构成。植物中已有大量关于类枯草杆菌蛋白酶基因的研究报道，包括大豆、番茄、拟南芥、木麻黄、柑橘等。

在植物中，拟南芥的类枯草杆菌蛋白酶基因研究的较为清楚。在拟南芥基因组中总共有56个Subtilisin家族成员，SUT1在拟南芥气孔前体细胞中强烈表达，影响叶片的分布和密度。Subtilisin家族在拟南芥中的发育调控、细胞周转和信号传导三个方面发挥功能。介导细胞与其他细胞之间的信号传导，促进拟南芥胚发育时期的表皮形成。燕麦中的Subtilisin-like基因参与细胞程序化死亡过程中的蛋白水解级联反应。

刺槐(Robinia pseudoacacia)属于雌雄同花植物，原生于北美洲，后被广泛引种到欧洲、亚洲等地。刺槐叶片含有大量粗蛋白，可作饲料；刺槐木质坚硬且具有发达的根系；刺槐根部有根瘤，有提高地力之效；刺槐具有很强的抗旱能力，能够适应石质山地的干旱环境。槐的花属于蝶形花，开花时香气四溢，并且可供食用。综上所述，刺槐具有很好的生态和经济价值。目前关于刺槐抗性的分子生物学研究基础还比较薄弱。

类枯草杆菌蛋白酶是植物受胁迫后诱导表达的一类蛋白质，他在植物受到抗旱、抗寒、抗盐、机械损伤等胁迫响应途径中具有重要作用^[13]。转基因研究也证明Subtilisin1基因在提高植物抗逆性中具有重要的作用。本文以刺槐Subtilisin1基因为研究对象，以刺槐的花为材料，克隆刺槐Subtilisin1基因并进行了生物信息学分析、表达模式分析，为将来刺槐抗性育种研究和分子育种工作提供理论基础。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种刺槐类枯草杆菌蛋白酶基因(即刺槐Subtilisin1基因)、刺槐Subtilisin1基因编码的蛋白、刺槐Subtilisin1基因克隆的引物以及克隆刺槐Subtilisin1基因的方法，本发明的刺槐Subtilisin1基因同源基因能在刺槐生长的各个阶段表达，而且能在刺槐的老化组织中的表达量高于幼嫩组织中的表达量，推测这是植物自身的一种防护机制，用来延缓组织衰老，同时为刺槐抗性育种研究和分子育种工作提供理论基础和科学依据，具有重要意义。

为实现本发明的上述目的，本发明一方面提供一种刺槐Subtilisin1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

本发明首先以刺槐的花为原料，提取总RNA，接着进行RNA的反转录，合成cDNA第一链；接着根据刺槐Subtilisin1基因的片段序列(即EST序列片段)设计PCR扩增引物，以合成的刺槐cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，得到刺槐Subtilisin1基因的序列中间片段(即EST系列片段)；然后再根据获得的保守序列中间片段分别设计5′-race扩增引物进行5′-端扩增；设计3′-race扩增引物进行3′-端扩增，得到刺槐Subtilisin1基因。

其中，进行PCR扩增的引物具体如下：

正向引物(SBTF)：5′-TGTTGTGAAGAAAGCCG-3′；

反向引物(SBTR)：5′-GTGAGGGCAAGCCATTGA-3′。

特别是，5′-race扩增引物包括一对5′-race锚定引物和一对扩增5′端引物。

尤其是，所述5′-race锚定引物具体如下：

AAP：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGG-3′；

AUAP：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′。

尤其是，所述扩增5′端引物具体如下：

5′race1R：5′-GAAGAAGATGAGCATCTC-3′；

5′race2R：5′-TTCCGTTAGCCAGAATCA-3′。

特别是，3′-race扩增引物包括一对3′-race锚定引物和扩增3′端引物。

尤其是，所述3′-race锚定引物具体如下：