[发明专利]刺槐类枯草杆菌蛋白酶基因、其编码蛋白、其克隆引物及其克隆方法

权利要求书

1.一种刺槐Subtilisin1基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2.一种刺槐Subtilisin1基因编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

3.一种刺槐Subtilisin1基因克隆的引物，其特征是所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、和SEQ ID No.12。

4.一种刺槐Subtilisin1基因的克隆方法，其特征是，包括如下顺序进行的步骤：

1)提取刺槐花中的总RNA，纯化后进行反转录，合成cDNA第一链；

2)以刺槐cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段；

3)根据刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段，进行5′-race扩增，获得5′-端扩增产物；

4)根据刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段，进行3′-race扩增，获得3′端扩增产物；

5)扩增产物进行拼接，即得该基因全长。

5.如权利要求4所述的克隆方法，其特征是，步骤2)中所述PCR扩增包括如下步骤：

2-1)根据刺槐Subtilisin1基因的片段序列设计一对中间片段扩增引物；

2-2)以步骤1)获得的刺槐cDNA第一链为模板，进行PCR扩增；

2-3)扩增产物进行拼接，获得刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段。

6.如权利要求4所述的克隆方法，其特征是，步骤2-1)中所述的引物分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

7.如权利要求4或5所述的克隆方法，其特征是，步骤3)中所述5′-race扩增包括如下步骤：

3-1)根据步骤2)获得的刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段设计5′-race扩增引物， 其中5′-race扩增引物包括一对5′-race锚定引物、一对扩增5′端引物；

3-2)以步骤1)获得的刺槐cDNA第一链为模板，利用一个5′-race锚定引物和一个扩增5′端引物进行第一轮5′-race扩增，获得第一轮5′-race扩增产物；

3-3)以第一轮5′-race扩增产物为模板，利用另一个5′-race锚定引物和另一个扩增5′端引物进行第二轮5′-race扩增，获得5′-端扩增产物。

8.如权利要求7所述的的克隆方法，其特征是，步骤3-1)中所述5′-race锚定引物分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；所述扩增5′端引物分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

9.如权利要求5或6所述的克隆方法，其特征是，步骤4)中所述3′-race扩增包括如下步骤：

4-1)根据步骤2)获得的刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段设计3′-race扩增引物，其中3′-race扩增引物包括一对3′-race锚定引物、一对扩增3′端引物；

4-2)以步骤1)获得的刺槐cDNA第一链为模板，利用一个3′-race锚定引物和一个扩增3′端引物进行第一轮3′-race扩增，获得第一轮3′-race扩增产物；

4-3)以第一轮3′-race扩增产物为模板，利用另一个3′-race锚定引物和另一个扩增3′端引物进行第二轮3′-race扩增，获得3′-端扩增产物。

10.如权利要求9所述的克隆方法，其特征是，步骤4-1)中所述3′-race锚定引物分别为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；所述扩增5′端引物分别为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示。