[发明专利]一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用，所述的构建体包括第一抗原结合单元和第二抗原结合单元，所述的第一抗原结合单元为特异性结合免疫细胞表面抗原的单链可变区抗体片段ScFV，所述的第二抗原结合单元为特异性结合肿瘤细胞表面抗原Robo1的Slit2D2蛋白片段。即所述的构建体能够同时结合免疫细胞表面抗原和肿瘤细胞表面Robo1分子，从而拉近肿瘤细胞和免疫细胞间的距离，有效激活静止的免疫细胞，起到杀伤肿瘤的效果，且具有分子量小、组织穿透性好等优点，对高表达Robo1肿瘤细胞具有显著的杀伤效果，可用于抗肿瘤药物的开发。

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，具体涉及一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用。

背景技术

Robo是一次跨膜的受体蛋白，在哺乳动物中，已经克隆到4个Robo基因。从物种进化的角度看，Robo1,2,3的胞外部分非常保守，从果蝇到人类都是由5个Ig样功能区和3个FibronectinIII型重复序列组成。Robos有很短的跨膜区域和一个较长的胞内区；按照序列的保守性，胞内区被划分为4个更小的区域，分别命名为：CC0,CC1,CC2,CC3。Robos胞外的IgG domains被认为是与配体Slit结合所必需的，较长的胞内区域则和一些重要的信号分子相互作用，参与Slit/Robo下游的信号转导，从而完成刺激信号由细胞外部到内部骨架的传递。目前，已完成slit2与Robo相互作用区域蛋白质的机构解析，发现slit2的第二个结构域D2与Robo1的Ig1结合，进而启动信号传导。

组织病理学检测显示Robo1在多种癌症中过表达，如肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤等。有研究显示Robo1在肝癌中大量表达，而在正常组织中只有少量表达，且84.7％的肝癌组织样本为阳性表达；80％的结肠癌患者的癌组织高度表达Robo1mRNA，45％的患者是正常组织的4倍，15％的患者是正常组织的12倍，因此Robo1可以作为一种新的肿瘤相关抗原，是一种潜在的治疗和诊断靶标。

分化簇3(CD3)分子仅存在于T细胞表面，常与T细胞受体(T cell receptor，TCR)紧密结合形成TCR-CD3复合体，具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。

本发明通过提供一种具有分别可结合CD3和Robo1的抗原结合部位的双特异性抗原结合构建体，可有效地激活静止的T细胞，达到杀伤病变细胞的目的。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种双特异性抗原结合构建体，所述的构建体包括第一抗原结合单元单元和第二抗原结合单元，所述的第一抗原结合单元为特异性结合免疫细胞表面抗原的单链可变区抗体片段(single-chain variable fragment，ScFV，又称为单链抗体)；所述的第二抗原结合单元为特异性结合肿瘤细胞表面抗原Robo1的Slit2D2片段，其具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；

优选的，所述的免疫细胞选自：T细胞、NKT细胞和CIK细胞；更优选为T细胞；

优选的，所述的第一抗原结合单元特异性结合免疫细胞表面抗原CD3；

优选的，所述的ScFV包括重链可变区结构域(heavy chain variable region，VH)和轻链可变区结构域(light chain variable region，VL)；所述的ScFV中，VH通过C末端与VL的N末端连接，或VH通过N末端与VL的C末端连接；所述的连接可为直接连接，无任何连接肽，即仅通过形成肽键实现连接；也可通过连接肽实现；优选的，所述的连接通过连接肽实现，所述的连接肽为含1-20个氨基酸的多肽，更优选为10-16个氨基酸，进一步优选为14个氨基酸；

所述的VH具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；