[发明专利]一种双特异性抗原结合构建体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种双特异性抗原结合构建体，所述的构建体包括第一抗原结合单元和第二抗原结合单元，所述的第一抗原结合单元为特异性结合免疫细胞表面抗原CD3的单链可变区抗体片段ScFV；所述的第二抗原结合单元为特异性结合肿瘤细胞表面抗原Robo1的Slit2D2片段；

所述的免疫细胞选自：T细胞、NKT细胞和CIK细胞；

所述的单链可变区抗体片段ScFV包括VH和VL；

所述的构建体选自SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8和SEQIDNO：9所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述的构建体的构建方式包括：VH-VL-Slit2D2、VL-VH-Slit2D2、Slit2D2-VH-VL、Slit2D2-VL-VH。

3.一种如权利要求1或2所述的构建体的制备方法，其具体步骤包括：

（1）重组载体的构建；

（2）转化体的制备和发酵；

（3）构建体蛋白的分离和纯化；

（4）构建体蛋白的鉴定，

步骤（1）包括以下具体步骤：

通过全基因合成得到编码构建体蛋白的基因片段，以其为模板，通过PCR扩增得到PCR产物，纯化回收，将其克隆至载体质粒中，将得到的重组载体转化到第一宿主细胞后转种到含有氨苄青霉素的固体培养基中进行繁殖、筛选阳性克隆、通过测序确认载体构建成功并保种；

所述的载体质粒为pCDNA质粒；

所述的第一宿主细胞包括但不限于大肠杆菌菌株；

步骤（2）包括以下具体步骤：

在第一宿主细胞中提取重组载体；

培养第二宿主细胞，当细胞密度达到2.5×10⁶细胞/毫升时转染已提取的重组载体，成功转染目标基因的第二宿主细胞为转化体，筛选转化体，进行转化体的发酵，5天后收集上清；所述的第二宿主细胞包括但不限于ExpiCHO细胞。

4.一种药物组合物，包括权利要求1或2所述的双特异性抗原结合构建体以及药学上可接受的辅料。

5.一种权利要求1或2所述的双特异性抗原结合构建体在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为高表达Robo1的肿瘤及相关疾病。