[发明专利]一种河蚌血蓝蛋白的提取方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种软体动物河蚌的血蓝蛋白的提取、纯化和冻干的方法。

背景技术

血蓝蛋白是存在于软体动物和节肢动物血淋巴中的含铜呼吸蛋白，它自由地悬浮于血淋巴中而不与血细胞结合，随着血淋巴的循环在动物体内运输氧气。血蓝蛋白具有多种生理功能，除了载氧功能以外，还具有酚氧化物酶活性，抗菌抗病毒活性，转运金属离子，储存蛋白质，调节渗透压，脱皮激素的载体，参与表皮的固化等作用。

30多年前，Curtis，Herseowitz和Weigle等人发现了软体动物的血蓝蛋白可以在实验动物和人身上均产生强烈的免疫激活作用(immunostimulatory properties)，可同时激活人体的体液免疫和细胞免疫(Curtis et al.，1970，1971；Herscowitz et al.，1972；Weigle，1964)。随后，在未经KLH免疫的人体中，也分别发现了能结合KLH的淋巴细胞(Hersh and Dyre，1974)和能与KLH起交叉反应的IgG抗体(Moroz et al.，1973；Burke et al.，1977)。

作为一种半抗原载体，血蓝蛋白用于同一些分子量较小的化合物、药物、激素、短肽、脂类、多糖、核苷酸等耦合，免疫机体，以产生特异性抗体。因此，血蓝蛋白在分子免疫方面用途相当广泛。

肿瘤学家还发现血蓝蛋白对一些癌症有非特异或特异的抑制作用，如血蓝蛋白可以有效地降低浅表性膀胱癌(superficial bladder eareinoma)的复发率(Olsson gt al.，1974)由于血蓝蛋白如此多样的功能，近年来成为国内外研究的热点领域，伴随着血蓝蛋白产品的市场需求也日益扩大。

河蚌是一类分布非常广泛的软体动物，它既具有食用价值，药用价值，又是淡水珍珠等水产养殖业重要的经济动物，具有可观的经济价值。国内大面积的河蚌养殖，可以成为软体动物血蓝蛋白的一个重要来源。本发明基于此，充分利用了国内的河蚌养殖资源，用生物工程的方法，规模化地、高效，简便地获取高纯度的血蓝蛋白，以满足市场需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种获取血蓝蛋白的方法，其中包括1)预处理河蚌样本；2)抽提河蚌心脏血；3)初步提纯血蓝蛋白；4)精细提纯血蓝蛋白；5)冷冻干燥，制成血蓝蛋白成品。

本发明用生物工程方法对血蓝蛋白进行规模化提取，纯化，冻干，所得产品具有高效的蛋白活性，与已知的方法相比，产量更高，蛋白产品更加稳定，制备工艺简便、安全。

本发明从河蚌中提取血蓝蛋白，所述河蚌包括珍珠蚌科和蚌科两个总科，10余种常见蚌科动物，如褶纹冠蚌、三角帆蚌、背角无齿蚌、背瘤丽蚌、圆顶珠蚌等。本发明优选来源是三角帆蚌。

本发明在45℃(±5℃)温水中对河蚌(三角帆蚌)进行预处理，剥离甲壳，用备有抗凝剂的注射器抽提心脏血，所述抗凝剂在柠檬酸钠，EDTA(乙二胺四乙酸)，肝素，水蛭素，枸橼酸钠等之间比较后，优选EDTA(乙二胺四乙酸)(pH 7.4，含500mmol/L NaCl，20mmol/L KCl，10mmol/L EDTA)以1∶5的比例加入血淋巴中。

本发明采用硫酸铵溶液分级沉淀，经实验比较后，优选7000×g，4℃离心1h，收集上清。而后上清用67％的硫酸铵分级沉淀(4℃，隔夜处理)。再次离心(7000×g，1h，4℃)，收集沉淀。

本发明采用色谱层析纯化获得高纯度血蓝蛋白，在一系列实验比较后，优选方案是：先进行凝胶过滤，收集洗脱的组分，再进行阴离子交换色谱分离纯化蛋白。

本发明对蛋白原液进行冻干，加入保护剂。在比较甘油、PVP40、海藻糖、甘氨酸、蔗糖、白蛋白、二甲亚砜(DMSO)、甘露醇、乳糖山梨醇D、L-苏氨酸等保护剂以后，优选方案是：0.8mol/L glycerol+15％PVP40+150mmol/L海藻糖+2％BSA；其中PVP和BSA的浓度单位为质量体积比，即100ml溶液中含有的溶质质量；海藻糖和渗透性保护剂的浓度单位为mmol/L.

附图说明

附图1：河蚌(三角帆蚌)血蓝蛋白Sephrose 4B纯化图谱(A)和SDS PAGE电泳图(B)

A：曲线上数字1～15分别代表接收的15管样品(1mL/管).B：条带1为蛋白质标准，条带2～5分别对应接收的1～2、3～7、8～11、12～15管样品(上样10μL).在pH7.0的10mmol/L Tris.HCI缓冲液(含有20mmol/L氯化钙)