[发明专利]一种将spacer序列克隆至CRISPR-Cas9系统中的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因组编辑技术领域，具体涉及一种将spacer序列克隆至CRISPR-Cas9系统中的方法及其应用。

背景技术

基于CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Small Palindromic Repeats)/Cas9系统的基因组编辑方法已经彻底改变了人类编辑基因组的历史。CRISPR/Cas9系统是原核生物中广泛存在的一套针对外源核酸分子入侵的适应性免疫系统，可以抵御噬菌体侵染，消灭偶然转化获得的质粒等。当细胞第一次被攻击后，入侵的DNA的部分序列有规律的整合到事先存在的CRISPR重复序列之间，称为间隔子(spacer)。当细胞再次受到攻击时，这段序列被一同转录为小分子RNA——crRNA(CRISPR RNA)。对于CRISPR II型系统，还存在一个小分子RNA——tracrRNA与crRNA形成二聚体，一同被加工、行使功能。与其他类型相比，CRISPR II型系统的结构是最紧凑的：唯一的蛋白酶CAS9在crRNA:tracrRNA双元分子的指导下入侵的DNA双链中形成R-loop。蛋白酶CAS9的两个内切酶活位点对DNA进行序列特异的切割。为了正确的识别外源DNA分子，spacer序列下游(5’-3’方向)存在PAM(Protospacer Adjacent Motif)基序5’-NGG-3’。为了便于载体构建，crRNA:tracrRNA双元分子可以融合为单个的sgRNA(single guide RNA)，其5’端20nt是负责识别特定基因的区域。这样只要同时表达CAS9蛋白和sgRNA就有可能实现基因组编辑。这种基于CRISPR/Cas9系统的技术不同于以往基于蛋白质的基因组编辑技术，CRISPR/Cas9系统对DNA进行特异的切割是由小分子RNA介导的，针对不同的靶标基因，只需要设计、替换不同的小分子RNA即可。如何简便的克隆对应的spacer序列就成为应用该系统的关键。

目前已经发表的CRISPR/Cas9质粒多采用了ⅡS型内切酶的策略来克隆spacer序列，因此实现无痕克隆的效果。常见的Ⅱ型内切酶由于具备6个碱基的回文结构，往往不利于无痕克隆，因此还没有用于克隆spacer序列。这种方法利用ⅡS型内切酶识别位点和切割位点不同的特点实现了无痕克隆。但是由于常用的ⅡS型内切酶数目有限，如Bsa Ⅰ、Bbs Ⅰ、BsmB Ⅰ和Sap Ⅰ，当把CRISPR/Cas9系统应用于不同生物时很容易由于载体骨架序列和其他调控原件序列的冲突，出现这些Ⅱ型内切酶无法使用的情况，因而有必要开发新的廉价的Spacer克隆方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种将靶基因spacer克隆至表达sgRNA的载体中的方法。

本发明提供的将靶基因spacer克隆至表达sgRNA的载体中的方法包括如下步骤：

1)改造表达sgRNA的载体、设计合成可退火形成带有粘末端片段的单链DNA分子A和单链DNA分子B；

所述改造表达sgRNA的载体通过包括如下步骤的方法进行：突变表达sgRNA的载体中第一个回文序列的上游且紧邻回文序列第一个碱基的碱基，使突变后碱基与所述第一个回文序列自5’末端起5个碱基形成能产生粘末端的酶切识别位点B，得到改造后表达sgRNA的载体；

所述表达sgRNA的载体中含有如下表达盒：从5’端起依次包括启动子、能产生粘末端的酶切识别位点A和用于结合Cas9蛋白的ncRNA编码DNA分子，所述启动子启动所述ncRNA 的表达；且所述表达sgRNA的载体不含有酶切识别位点B；

所述单链DNA分子A从5’端至3’端依次由所述酶切识别位点A粘末端、靶基因spacer和DNA片段乙组成；

所述单链DNA分子B从5’端至3’端依次由所述酶切识别位点B粘末端、DNA片段乙反向互补片段和靶基因spacer反向互补片段组成；

所述DNA片段乙为所述表达sgRNA的载体中位于所述酶切识别位点A和所述第一个回文序列之间的片段；

2)将所述单链DNA分子A和所述单链DNA分子B退火，形成带有酶切识别位点A粘末端、靶基因spacer和酶切识别位点B粘末端的片段丙；