[发明专利]一种将spacer序列克隆至CRISPR-Cas9系统中的方法及其应用

权利要求书

1.一种将靶基因spacer克隆至表达sgRNA的载体中的方法，包括如下步骤：

1)改造表达sgRNA的载体、设计合成可退火形成带有粘末端片段的单链DNA分子A和单链DNA分子B；

所述改造表达sgRNA的载体通过包括如下步骤的方法进行：突变表达sgRNA的载体中第一个回文序列的上游且紧邻回文序列第一个碱基的碱基，使突变后碱基与所述第一个回文序列自5’末端起5个碱基形成能产生粘末端的酶切识别位点B，得到改造后表达sgRNA的载体；

所述表达sgRNA的载体中含有如下表达盒：从5’端起依次包括启动子、能产生粘末端的酶切识别位点A和用于结合Cas9蛋白的ncRNA编码DNA分子，所述启动子启动所述ncRNA的表达；且所述表达sgRNA的载体不含有酶切识别位点B；

所述单链DNA分子A从5’端至3’端依次由所述酶切识别位点A粘末端、靶基因spacer和DNA片段乙组成；

所述单链DNA分子B从5’端至3’端依次由所述酶切识别位点B粘末端、DNA片段乙反向互补片段和靶基因spacer反向互补片段组成；

所述DNA片段乙为所述表达sgRNA的载体中位于所述酶切识别位点A和所述第一个回文序列之间的片段；

2)将所述单链DNA分子A和所述单链DNA分子B退火，形成带有酶切识别位点A粘末端、靶基因spacer和酶切识别位点B粘末端的片段丙；

3)将所述片段丙通过酶切连接替换所述改造后表达sgRNA的载体中的所述酶切识别位点A和所述酶切识别位点B之间的片段，得到重组载体，实现靶基因spacer克隆至表达sgRNA的载体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述改造表达sgRNA的载体方法中，在所述突变表达sgRNA的载体中第一个回文序列的上游且紧邻回文序列第一个碱基的碱基后还包括如下步骤：突变所述表达sgRNA的载体中第一个回文序列的上游的某个碱基，该碱基与所述回文序列的第一个碱基间隔一个碱基，使突变后的碱基不产生甲基化位点。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步骤3)包括如下步骤：用识别所述酶切识别位点A的酶和识别所述酶切识别位点B的酶酶切所述改造后表达sgRNA的载体，得到带有酶切识别位点A粘末端和酶切识别位点B粘末端的载体骨架；再将所述片段丙与所述载体骨架连接。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

所述表达sgRNA的载体的核苷酸序列为序列1；

所述第一个回文序列为序列1第3132-3136位所示的核苷酸分子；

所述ncRNA编码DNA分子为序列1第3123-3204位所示的核苷酸分子；

所述酶切识别位点B为Xba Ⅰ；

所述酶切识别位点A为Nco Ⅰ；

所述DNA片段乙为序列1第3123-3131位所示的核苷酸分子；

所述改造后表达sgRNA的载体的核苷酸序列为序列2。

5.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

所述表达sgRNA的载体的核苷酸序列为序列3所示的核苷酸分子；

所述第一个回文序列为序列3第3132-3136位所示的核苷酸分子；

所述ncRNA编码DNA分子为序列3第3123-3258位所示的核苷酸分子；

所述酶切识别位点B为Avr Ⅱ；

所述酶切识别位点A为Nco Ⅰ；

所述DNA片段乙为序列3第3123-3131位所示的核苷酸分子；

所述改造后表达sgRNA的载体的核苷酸序列为序列4。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：

所述靶基因spacer大小为20nt。

7.由权利要求1-6任一所述方法制备的重组载体。

8.由权利要求1-6中任一所述方法制备的改造后表达sgRNA的载体。

9.权利要求1-6中任一所述的方法或权利要求7所述的重组载体或权利要求8所述的改造后表达sgRNA的载体在用Cas9基因编辑靶基因中的应用。