[发明专利]一种利用毕赤酵母高效分泌表达转肽酶Sortase A的方法

说明书

本发明公开了一种利用毕赤酵母高效分泌表达转肽酶Sortase A的方法，属于基因工程领域。本发明成功实现了Sortase A在毕赤酵母中的高效分泌表达，解决了目前已有报道中该酶在大肠杆菌胞内表达中存在的产率较低、菌体需要破壁和菌株不稳定的问题。经过表达策略的筛选和发酵条件优化，胞外Sortase A的酶活和浓度分别可达131.9U/mL和97.8mg/L。本发明通过实现Sortase A的高效分泌表达，为该酶的工业化生产及其在蛋白质工程领域的应用打下了基础。

技术领域

本发明涉及一种利用毕赤酵母高效分泌表达转肽酶Sortase A的方法，属于基因工程领域。

背景技术

Sortase A是一类介导革兰氏阳性菌细胞壁锚定蛋白与细胞壁共价结合的转肽酶，近些年其在生物技术领域的应用吸引了越来越多的关注。自从2004年首次报道应用Sortase A作为一种蛋白质或多肽的连接工具以来，Sortase A参与的连接反应迅速成为一个研究热点，已被广泛应用于生物化学、蛋白质组学、生物医药以及生物工程技术等领域。但到目前为止，关于Sortase A高效表达和工业化生产的研究却很少，酶的表达方式仍主要局限于大肠杆菌的胞内表达。Sortase A的胞内表达存在以下几个主要的缺陷：(1)产率较低：在已有的报道中，最高产率仅为76.9mg/L；(2)胞内表达的Sortase A易在菌体内形成包涵体，且纯化前还需要经过耗时且成本较高的细胞破碎步骤；(3)Sortase A的表达载体是游离型的质粒，易于丢失，会导致生产菌株的发酵特性不稳定容易退化。因此，急需实现Sortase A的高效分泌表达，以满足未来在蛋白质工程、酶工程中对Sortase A日益增长的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题首先是提供一种高效分泌表达转肽酶Sortase A的重组毕赤酵母，用于实现Sortase A的高效分泌表达。

所述重组毕赤酵母是以pPIC9k(含α信号肽)为表达载体，选择AOX1或GAP启动子，以毕赤酵母GS115、SMD1168或KM71为表达宿主，构建得到分泌表达Sortase A的基因工程菌株。

在本发明的一种实施方式中，以AOX1为启动子。

在本发明的一种实施方式中，以毕赤酵母SMD1168为宿主。

在本发明的一种实施方式中，以AOX1为启动子、SMD1168为宿主，构建得到一株重组毕赤酵母。

本发明还提供了一种应用重组毕赤酵母生产转肽酶Sortase A的方法，是将重组毕赤酵母诱导培养使其表达转肽酶Sortase A。

在本发明的一种实施方式中，重组毕赤酵母在BMGY培养基中活化。所述BMGY培养基含13.4g/L不含氨基酸的YNB，20g/L蛋白胨，10g/L酵母膏，10g/L甘油，100mM磷酸盐。

在本发明的一种实施方式中，活化后的重组毕赤酵母转接至初始pH6.0的BSM无机培养基中，28℃诱导产酶，每隔24h加入1.5％含微量元素的纯甲醇进行诱导表达，诱导培养72h。所述BSM无机培养基含26.7ml/L磷酸，0.93g/L硫酸钙，18.2g/L硫酸钾，14.9g/L硫酸镁，4.13g/L氢氧化钾，40g/L甘油。所述含微量元素的纯甲醇是含CuSO₄·5H₂O 6.0g/L，KI0.088g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃0.02g/L，CoCl₂·6H₂O 0.5g/L，ZnCl₂ 20.0g/L，FeSO₄·7H₂O 65.0g/L，Biotin 0.2g/L，浓H₂SO₄5.0mL/L的纯甲醇。