[发明专利]一种AaPDR2基因启动子及其功能验证方法和应用

说明书

本发明涉及一种AaPDR2基因启动子及其功能验证方法和应用。该AaPDR2基因启动子包括以下顺式作用元件：ABRE、Box I、CAAT‑box、CCAAT‑box、CGTCA‑motif、G‑Box、G‑box、GA‑motif和TATA‑box。进一步地，该AaPDR2基因启动子的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。该AaPDR2基因启动子具有在青蒿幼叶分泌型和非分泌型腺毛中优势表达其引导的基因的功能，该功能通过GUS报告基因得到证实。因而本发明对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种AaPDR2基因启动子及其功能验证方法和应用。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。其地上部分所提取的含有过氧桥的倍半萜内酯氧化物——青蒿素，是目前应用最广泛，疗效最好的抗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，青蒿素联合疗法(ACTs)是世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法。但青蒿素在植物青蒿中的含量低，尚无法完全满足全球的市场需求。青蒿的叶片表面有两种腺毛：分泌型腺毛(glandular secretory trichome，GST)和非分泌型腺毛(T shape trichome，TST)，两种腺毛对于植物的生长、发育、防御、花粉传播等都起到至关重要的作用，与青蒿素含量的高低也密切相关。启动子是位于结构基因5'端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，启动子就像一个“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功能。

ATP结合盒式(ATP binding cassette，ABC)转运蛋白是一大类非常多样化非常特殊的超级家族。大部分ABC转运蛋白直接参与到各种分子的跨膜运输。AaPDR2是从青蒿中克隆得到的一个ABC转运蛋白中多药耐药(Pleiotropic drug resistance，PDR)亚家族的转运蛋白。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，这类启动子能够驱动基因在植物所有的组织和器官中表达，会导致植物体内代谢的浪费，还可能对植物的正常生长造成一定的负担和危害。因此，克隆青蒿多药耐药转运蛋白2(AaPDR2)基因启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。经对现有技术文献的检索发现，尚未发现有与本发明的AaPDR2基因启动子序列相关的报道。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种青蒿腺毛优势表达的基因(AaPDR2)启动子。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种中青蒿特定部位优势表达的启动子。本发明涉及基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、代谢产物检测。

本发明提供一种AaPDR2基因启动子，所述AaPDR2基因启动子的DNA序列包括以下顺式作用元件：ABRE、Box I、CAAT-box、CCAAT-box、CGTCA-motif、G-Box、G-box、GA-motif和TATA-box。以上顺式作用元件的详细描述见表1。

表1 AaPDR2基因启动子序列中的顺式作用元件分析

进一步地，所述AaPDR2基因启动子的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种如上所述的AaPDR2基因启动子的功能验证方法，包括以下步骤：

步骤一、培养青蒿无菌苗；

步骤二、提取所述步骤一中培养的青蒿无菌苗基因组，以此克隆所述AaPDR2基因启动子；

步骤三、分析调控基因在所述AaPDR2基因启动子上面的顺式作用元件，确定所述AaPDR2基因启动子的类型；