[发明专利]一种用于人源性MANF基因检测的地高辛探针及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因技术领域，涉及一种探针，尤其涉及一种用于人源性MANF基因检测的地高辛探针及其应用。

背景技术

神经营养因子对神经细胞存活、生长、分化有重要作用，因而被用于神经保护、再生及功能修复的研究。中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(Mesencephalic Astropcyte-derived Neurotrophic Factor，MANF)是于2003年在体外传代培养的大鼠中脑I型星形胶质细胞的培养基中首次分离到的，分子量为20kDa，属于保守性的MANF蛋白家族。该蛋白是一种分泌性蛋白，主要在神经元中表达，而胶质细胞中表达较少。研究表明脑缺血损伤和神经细胞中多种内质网应激可上调MANF的表达，体外实验证实MANF能促进神经细胞的增殖，并能对抗多种刺激引起的神经细胞凋亡，体内实验也显示MANF蛋白对6-OHDA引起的多巴胺能神经元的损伤具有预防和治疗作用。由于MANF蛋白对神经元损伤具有保护和治疗作用，许多研究将其应用于治疗神经退行性疾病，以阻止病程的发展加快疾病的恢复。帕金森病(Parkinson Disease,PD)是一种典型的神经退行性疾病，其主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性死亡，目前已有不少研究者采用MANF蛋白对PD动物模型进行治疗的研究。

MANF用于临床治疗帕金森病的主要障碍之一是血脑屏障。研究证明，分子质量小于500Da的亲脂性小分子才能顺利通过血脑屏障，MANF作为大分子蛋白，无法透过血脑屏障，立体定向脑内注射又会导致手术相关损伤无法重复进行，限制了其应用于临床的可能性。腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)是微小病毒科(Parvoviridae)家族的成员之一。作为一种基因导入系统，AAV病毒载体具有安全性好，免疫原性低，能感染分裂细胞和非分裂细胞，能介导基因的长期稳定表达等优点，例如一项研究帕金森发明机制的模型中，通过对大鼠 模型脑内黑质部位立体定向注射可表达α-突触核蛋白的重组AAV病毒研究该蛋白的多巴胺能神经元损伤机制，研究发现大鼠脑中可持续表达α-突触核蛋白，并且大鼠表现出多巴胺能神经元功能损伤的行为特征，说明重组AAV病毒可有效介导有功能活性的α-突触核蛋白在脑内的表达。因此AAV病毒在神经系统疾病的体内和体外研究中，受到越来越多的关注和重视。

重组AAV病毒或其他重组病毒载体在实际应用中往往涉及到病毒滴度的确定问题，根据所包装的重组病毒中目的基因的含量确定重组病毒滴度，可有效避免空壳病毒蛋白组分的干扰，因此对含有MANF基因的重组病毒的滴度测定可通过MANF基因的定量检测来确定。目前针对MANF基因定量的检测方法主要是荧光定量PCR法，该方法需要特定的仪器，实验要求高。斑点杂交是基因定量检测的一种可靠方法，可通过特异性探针的设计来实现，对实验设备要求不高。该方法原理是：具有同源性的杂交探针与目的基因在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则杂交形成双链，通过对探针显影检测到杂交信号。此种方法具有较高的检测特异性，目前尚未有针对人源性MANF基因检测的杂交探针。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题，提出了一种高效的用于人源性MANF基因检测的特异性地高辛探针及其方法。

为了解决上述的技术问题，本发明所采取的技术措施为：

本发明的第一个方面涉及一种用于人源性MANF基因检测的地高辛探针，其特征在于，所述的用于人源性MANF基因检测的地高辛探针序列如SEQ NO：1所示。

本发明的第二个方面涉及上述的用于人源性MANF基因检测的地高辛探针在病毒滴度检测方法中的应用。

本发明第三个方面涉及一种斑点杂交检测方法，该斑点杂交检测方法包括上述所述的地高辛探针，该斑点杂交检测方法为DNA斑点杂交检测方法，检测方法包括以下步骤：

步骤1：标准品和样品DNA变性后分别点加在硝酸纤维素膜的表面；

步骤2：将步骤1中处理得到的硝酸纤维素膜放入杂交缓冲液中进行预杂交；

步骤3：将权利要求1所述的地高辛探针变性后加入到杂交缓冲液中形成探针杂交液，往步骤2处理得到的硝酸纤维素膜上加入探针杂交液，然后温和振荡孵育24小时；

步骤4：将步骤3处理得到的硝酸纤维素膜用洗涤液进行洗涤；

步骤5：将步骤4处理得到的硝酸纤维素膜进行免疫检测。

优选地，上述的硝酸纤维素膜是带正电荷的尼龙膜。