[发明专利]肝组织HBVcccDNA定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明主要技术方法为实时荧光定量PCR(Quantitativereal-timePCR，qRT-PCR)，该技术的基本原理是以分子杂交、基因扩增、光电三项为基础，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通过分析软件对PCR的反应进行检测分析的技术。

背景技术

19世纪80年代，Miller等采用DNA电泳及Southern杂交检测技术，首次证实慢性乙型肝炎患者肝组织内存在一种电泳带位置为2.0kb的HBVDNA分子，并在电镜下证实为大小约3.2kb的超螺旋DNA分子，首次发现并报道了HBVcccDNA的存在。此后，学者们不断进行探索，20世纪90年代，PCR技术开始应用于HBVcccDNA的检测。Kock等建立了选择性PCR方法检测人PBMC中的HBVcccDNA，该方法利用rcDNA结构上存在缺口的特点，设计了跨越缺口的引物，使结构完整的HBVcccDNA得以选择性扩增；但当rcDNA浓度较高时，高于105copy即可出现非特异的扩增产物，影响了该方法的特异性，也限制了其的进一步应用。Addison等在以上Kock等方法的基础上通过引入竞争性PCR，初步实现了HBVcccDNA的定量检测，并将其用于鸭肝组织中HBVcccDNA的检测，此方法先将PCR产物酶切，再将酶切产物电泳，最后对待测标本进行密度扫描后得出其中HBVcccDNA的相对含量，即该方法未实现对HBVcccDNA的定量检测。香港学者He等建立了选择性实时荧光定量PCR方法，对HBVcccDNA进行定量检测；该方法通过加入荧光探针将普通PCR法的终点检测变为实时动态检测，在很大程度上避免了rcDNA的非特异性扩增，但此法对扩增模板未用能降解rcDNA的酶处理，亦影响了其扩增的特异性。尽管学者们不断改进检测HBVcccDNA的方法，但特异性和敏感度仍是目前HBVcccDNA检测技术所面临的主要问题。同时，先前研究多集中于对细胞模型和动物的

肝脏模型中HBVcccDNA的检测应用。迄今为止，国内外尚无公认的、较稳定的并得到相关部门正式批准的用于检测HBVcccDNA试剂盒的问世，因此，建立一种快速、灵敏、特异地检测肝细胞内HBVcccDNA方法十分必要。

发明内容

鉴于目前技术存在的上述不足，本发明提供肝组织HBVcccDNA定量PCR检测方法，本发明能实现对肝组织中HBVcccDNA、β-actin进行灵敏，特异的扩增，并通过β-actin的测定，实现HBVcccDNA在肝细胞中的量化，可用于临床肝组织及肝细胞中HBVcccDNA的检测及应用。

本发明的采用如下技术方案：

肝组织HBVcccDNA定量PCR检测方法，包括以下步骤：

提取肝组织中基因组DNA标本；

构建肝组织内参基因β-actin质粒标准品；

以P1.2Ⅱ质粒作为检测HBVcccDNA的标准品，对标本的HBVcccDNA进行定量PCR扩增。

作为本发明的优选技术方案，所述提取肝组织中基因组DNA标本的步骤包括：

将肝组织磨碎，移入1.5mlEP管中，加200μl缓冲液GA，震荡至彻底悬浮；

在上述悬浮液中加入20μl蛋白酶K溶液并混匀得到第一混合溶液，其中混匀条件为56℃，3h；

将上述第一混合溶液进行离心后加入200μl缓冲液GB并混匀得到第二混合溶液，其中混匀条件为70℃，10min；

将上述第二混合溶液进行离心后加入200μl无水乙醇震荡混匀得到第三混合溶液，其中震荡时间为15sec；

将上述第三混合溶液加入吸附柱CB3中，其中吸附柱放入收集管中；

将吸附柱CB3中溶液在12,000rpm条件下进行离心30sec弃废液，加入500μl缓冲液GD得到第四混合溶液；

将第四混合溶液在12,000rpm条件下离心30sec后弃废液，加入600μl的漂洗液PW得到第五混合溶液；

将第五混合溶液在12,000rpm，离心30sec后弃废液，加入600μl的漂洗液PW并弃废液，将吸附柱放入收集管中后在12,000rpm条件下，离心2min得到第六混合溶液；

将第六混合溶液弃废液，吸附柱置于室温数分钟后将吸附柱转入一清洁EP管中，悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，然后室温放置5min，12,000rpm，离心2min得到洗脱的DNA。