[发明专利]肝组织HBVcccDNA定量PCR检测方法

权利要求书

1.肝组织HBVcccDNA定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取肝组织中基因组DNA标本；

构建肝组织内参基因β-actin质粒标准品；

以P1.2Ⅱ质粒作为检测HBVcccDNA的标准品，对标本的HBVcccDNA进行定量PCR扩增。

2.根据权利要求1所述的肝组织HBVcccDNA定量PCR检测方法，其特征在于，所述提取肝组织中基因组DNA标本的步骤包括：

将肝组织磨碎，移入1.5mlEP管中，加200μl缓冲液GA，震荡至彻底悬浮；

在上述悬浮液中加入20μl蛋白酶K溶液并混匀得到第一混合溶液，其中混匀条件为56℃，3h；

将上述第一混合溶液进行离心后加入200μl缓冲液GB并混匀得到第二混合溶液，其中混匀条件为70℃，10min；

将上述第二混合溶液进行离心后加入200μl无水乙醇震荡混匀得到第三混合溶液，其中震荡时间为15sec；

将上述第三混合溶液加入吸附柱CB3中，其中吸附柱放入收集管中；

将吸附柱CB3中溶液在12,000rpm条件下进行离心30sec弃废液，加入500μl缓冲液GD得到第四混合溶液；

将第四混合溶液在12,000rpm条件下离心30sec后弃废液，加入600μl的漂洗液PW得到第五混合溶液；

将第五混合溶液在12,000rpm，离心30sec后弃废液，加入600μl的漂洗液PW并弃废液，将吸附柱放入收集管中后在12,000rpm条件下，离心2min得到第六混合溶液；

将第六混合溶液弃废液，吸附柱置于室温数分钟后将吸附柱转入一清洁EP管中，悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，然后室温放置5min，12,000rpm，离心2min得到洗脱的DNA。

3.根据权利要求2所述的肝组织HBVcccDNA定量PCR检测方法，其特征在于，所述构建肝组织内参基因β-actin质粒标准品的步骤包括：

β-actin实时荧光定量PCR引物、探针的设计与合成，其中β-actin引物、探针序列为：

上游F5＇-CTGCAGGTCGACGATTGGACTCCGGTGACGGGGTCA-3＇

下游R5＇-GGATCCTCTAGAGATTATGACCTGGCCGTCAGGCAG-3＇

探针P5＇-(FAM)CGGCTACAGCTTCACCACCACGGC(Eclipse)-3＇；

β-actin质粒标准品的反应体系为：PremixExTaqTM12.5μl，F1μl，R1μl，探针P1μl，模板2μl，dH2O8.5μl，其中所述F、R的浓度为10μmol/L，探针P的浓度为5μmol/L，反应条件为：95℃30sec，95℃5sec、55℃10sec、72℃20sec，45个循环。

4.根据权利要求1所述的肝组织HBVcccDNA定量PCR检测方法，其特征在于，所述以P1.2Ⅱ质粒作为检测HBVcccDNA的标准品，对标本的HBVcccDNA进行定量PCR扩增的步骤包括：

对提取模板进行PSAD酶切纯化：所述模板PSAD酶切的反应体系为核酸提取产物10μL，PSAD酶1μL，25mMATPSoLution0.8μL，10xReactionBuffer2μL，dH2O6.2μL，其中PSAD酶的浓度为10U/μl，其中反应条件为：37℃水浴1h酶切消化，然后70℃水浴30min灭活PSAD酶；

第一轮普通PCR扩增得到扩增产物，其中反应体系为：酶切后产物2μl，P11μl，P21μl，2xMix12.5μl，dH2O9.5μl，其中P1、P2的浓度为5μmol/L，反应条件为：93℃5min，93℃45sec，58℃45sec，15个循环。

5.根据权利要求4所述的肝组织HBVcccDNA定量PCR检测方法，其特征在于，所述将上述扩增产物用内引物和荧光探针进行定量PCR扩增，其中反应体系为第一轮PCR产物1μl，P31μl，P41μl，探针1μl，RealMasterMix(2.5x)10μl，20xProbeEnhancer1.25μl，dH2O11.75μl，其中所述P3、P4、探针的浓度为5μmol/L，其中反应条件：93℃3min，93℃20sec，55℃30sec，45个循环。