[发明专利]基于线粒体COⅠ基因的畜禽肉中猪牛羊源性成分鉴别PCR专用引物对及PCR鉴定方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及引用PCR方法快速有效地鉴别畜禽肉中猪、牛、羊源性成分，适用于上述三种动物肉类源性快速检测与真假鉴别。

背景技术

伴随着我国食品工业的飞速发展，食品掺假方式越来越多，范围越来越广，内容越来越复杂。目前国内市场上肉与肉制品销售中，利用掺杂掺假、以次充好的手段欺骗消费者谋取暴利的事件频频出现。例如部分不法企业为了谋取不当利益，使用猪肉为原料，通过加工处理后冒充牛肉、羊肉进行销售，假冒的牛羊肉卷已多次被媒体曝光，严重损害了消费者利益，扰乱了市场秩序，特别是“牛肉膏”事件的曝光使得肉类掺假进一步成为公众关注的焦点。在这样的实际形势下，传统的以经验为主的感官鉴别方法已不能满足科学监管的需要，迫切需要建立一种科学、准确、快速的食品中肉类成分种属鉴定技术，以便打击肉与肉制品掺假现象，从而维护市场秩序。

近10多年来，应用分子生物学方法对食品中肉类成分进行鉴别的技术不断发展，其中以聚合酶链式反应（PCR）为基础的技术已逐步成为了肉类种属鉴定的核心方法。PCR技术具有特异性强、操作简便、快速高效等特点，在肉类掺假检测方面具有巨大的应用价值。研究者根据不同物种基因序列中的位点差异，设计物种特异性引物进行PCR扩增，利用PCR反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别食品中可能的物种来源，从而对包括肉类在内的食品本质进行确认。而在目标基因的选择方面，线粒体基因组DNA序列具有高度的种属保守性以及物种特异性，且拷贝数多，并具有抗腐蚀、耐高温的特点，因此线粒体DNA多态性位点是设计肉类成分定性鉴别方法的首选靶点。

近年来，国内外根据线粒体编码基因的差异进行食品鉴定的方法不断出现，哺乳动物线粒体编码的细胞色素b基因、12srRNA基因等均成为设计物种特异性扩增引物的良好靶标。然而，基于线粒体DNACOⅠ基因建立畜禽肉中猪、牛、羊源性成分鉴别的方法还未见相关报道。

针对我国畜禽类肉食品市场贸易中动物源性成分检测的迫切需要，建立能够鉴别大量常见物种包括猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭以及鹅等动物肉中猪、牛、羊源性成分的PCR方法，对食品进行动物源性成分鉴定，是提高肉品真假鉴别效率的有效途径之一，对打击牛、羊肉假冒伪劣，规范市场秩序，提升食品安全监管能力具有重要意义，有利于肉类产业健康发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种畜禽肉猪、牛、羊源性快速鉴别的PCR专用引物对及PCR方法与试剂盒，利用所设计的引物对组合和方法可快速准确的检测畜禽肉中猪、牛、羊源性成分，并可对牛、羊肉真伪和掺假进行识别。

本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明通过比对分析猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭、鹅九种动物线粒体DNACOⅠ基因的差异性位点，设计猪、牛、羊的特异性PCR引物对，其仅对相应的物种总DNA模板有扩增信号，对其它物种没有目的扩增信号。

本发明提供了猪、牛、羊三种动物PCR鉴定用引物体系，由下列引物对组成：

（1）对猪COⅠ基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对Ⅰ：

正向引物序列为：GTTTTGGTAACTGACTCGTA，

反向引物序列为：CTTCTACTATTGAGGATGCC；

（2）对牛COⅠ基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅱ：

正向引物序列为：CCTAACAGCAGTTATACTAATAG，

反向引物序列为：GTGGTTAAGTCTACAGTCAAG；

（3）对羊COⅠ基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对Ⅲ：

正向引物序列为：CTAACTATTTTCTCCCTACATC，

反向引物序列为：ACAAGGGGGTTTGATAC。

本发明还提供了一种猪肉、牛肉、羊肉的PCR鉴定方法。以样品总DNA为模板，利用所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ分别进行PCR扩增实验，反应结束后根据1.5%琼脂糖凝胶电泳判定结果，所述样品总DNA模板来自猪、牛、羊、兔、鸽、鹌鹑、鸡、鸭、鹅肌肉样品的混合，或上述各物种肌肉样品的一种。