[发明专利]基于线粒体COⅠ基因的畜禽肉中猪牛羊源性成分鉴别PCR专用引物对及PCR鉴定方法和试剂盒

权利要求书

1.一种畜禽肉中猪牛羊源性成分PCR鉴定专用引物对，其特征在于：所述专用引物对包括：

（1）对猪COⅠ基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对Ⅰ：

正向引物序列为：GTTTTGGTAACTGACTCGTA；

反向引物序列为：CTTCTACTATTGAGGATGCC；

（2）对牛COⅠ基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅱ：

正向引物序列为：CCTAACAGCAGTTATACTAATAG；

反向引物序列为：GTGGTTAAGTCTACAGTCAAG；

（3）对羊COⅠ基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对Ⅲ：

正向引物序列为：CTAACTATTTTCTCCCTACATC；

反向引物序列为：ACAAGGGGGTTTGATAC。

2.利用权利要求1所述的PCR鉴定专用引物对进行畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定方法，其特征在于：所述PCR鉴定方法为：提取待测物种总DNA；将提取的待测物种总DNA样品溶于100ul洗脱液TE中，于-20℃保存备用；以待测物种总DNA为模板，利用权利要求1中所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ分别进行PCR扩增，反应完毕后将PCR产物取出，利用1.5%的低溶点琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ分别扩增出的DNA片段大小，其中

当引物对Ⅰ扩增出的DNA片段大小为129bp，判定待测物种为猪；129bp扩增片段为：

GTTTTGGTAACTGACTCGTACCGCTAATAATCGGAGCTCCCGATATGGCCTTTCCACGTA60

TAAACAACATAAGTTTCTGACTACTTCCACCATCCTTCCTATTACTACTGGCATCCTCAA120

TAGTAGAAG129；

当引物对Ⅱ扩增出的DNA片段大小为84bp，判定待测物种为牛；84bp扩增片段为：

CCTAACAGCAGTTATACTAATAGTTTTCATCATCTGAGAAGCATTTGCATCTAAACGAGA60

AGTCTTGACTGTAGACTTAACCAC84；

当引物对Ⅲ扩增出的DNA片段大小为118bp，判定待测物种为羊；118bp扩增片段为：

CTAACTATTTTCTCCCTACATCTGGCAGGTGTCTCTTCAATTCTAGGAGCCATTAATTTT60

ATTACAACTATTATTAATATAAAACCCCCTGCGATGTCACAGTATCAAACCCCCTTGT118。

3.根据权利要求2所述的畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增反应体系为20μL体系：2×PCRMix10ul，10μmol/L引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ正向引物0.3μL、10μmol/L引物对Ⅰ或引物对Ⅱ或引物对Ⅲ反向引物0.3μL，模板DNA1μL，双蒸灭菌水8.4μL。

4.根据权利要求2或3所述的畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增反应程序为：先进行95℃预变性5min；然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，进行30个循环；最后72℃延伸10min。

5.根据权利要求4所述的畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定方法，其特征在于：所述提取待测样本DNA的方法为：采用离心柱式组织基因组DNA抽提试剂盒进行提取。

6.一种畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定用试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ。

7.如权利要求6所述的畜禽肉中猪牛羊源性PCR鉴定用试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒用于单物种总DNA模板或多物种总DNA模板进行畜禽肉中猪、牛、羊源性鉴定。