[发明专利]一种重组纤维结构胶原蛋白海绵的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，尤其涉及一种重组纤维结构胶原蛋白海绵的制备方法。

背景技术

I 型胶原是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，在肌腱和韧带、皮肤、血管、角膜、骨等组织中都有分布。胶原通过其独特的结构来实现不同组织中对力学特性的不同要求，起着稳定、支撑，提供强度的作用。I 型胶原纤维可溶于酸溶液中，当 pH和温度升髙至一定程度时，会在体外重组形成纤维。胶原是一种特殊可生物降解的材料，人体内的胶原酶能使胶原降解为各种片段，在体温下这些大片段很快自发变性，被其他酶进一步降解成寡肽或氨基酸。或者被结缔组织细胞核炎症细胞吞噬，并由溶酶体将其进一步降解。胶原蛋白海绵与血液接触，利用其海绵结构的毛细作用，迅速吸附血液，引起血小板聚集，破坏血小板，激活内源性凝血因子，产生凝血酶，凝血酶再催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，使血液凝固。现有纯胶原蛋白海绵在应用过程中往往降解快、力学性能差，机械强度低，并且海绵在湿润环境下很难维持自身固有形态，容易坍塌。

发明内容

本发明解决的技术问题在于：提供一种胶原蛋白海绵，克服了传统胶原蛋白海绵只能利用海绵结构吸收血液中的水分进行物理止血，止血效果欠佳的问题，以实现微纤维显微结构进行生物止血的功能。

本发明解决的又一技术问题在于：提供胶原蛋白海绵的制备方法，克服了现有制备方法透析技术耗时长、效率低以及制备的胶原蛋白海绵上血效果差等缺点，以高效地制备表面具有微纤维结构的胶原蛋白海绵，能够快速止血。

本发明的技术方案之一：提供一种重组纤维结构胶原蛋白海绵，具有海绵状，胶原蛋白海绵表面具有胶原的微纤维结构，其胶原分子以纤维形式存在，且具有三维螺旋结构。

本发明的技术方案之二：提供制备胶原蛋白海绵的方法，包括以下步骤：

步骤1，利用切向流过滤技工艺对胶原蛋白的纯化及浓缩；

步骤2，纯化浓缩的胶原溶液与一定体积的生物缓冲液进行混合，缓冲液中含有5~20ppm交联剂，且混合时缓冲液的温度为30±0.5℃，调节pH为6.5~8.5，进行分子自组装；

步骤3，离心，弃上清液，获得浑浊液；

步骤4，凝胶化且进行交联；

步骤5，在不同温度下进行反复预冻、解冻及水洗；

步骤6，冷冻干燥。

优选地，所述胶原分子具体有三螺旋结构，能保留其原有的生物学性能，能够吸引原纤维和粘附血小板，随后发生释放反应，触发血小板凝集，并在其纤维间隙内形成血栓。所述胶原蛋白海绵是利用切向流过滤技工艺进行胶原蛋白的纯化及浓缩；在体外进行分子自组装；离心分离；凝胶化；反复预冻、解冻及水洗；冷冻干燥等工艺方法而制得。

本发明的胶原蛋白海绵在动物体内2周已逐步降解，4-8周能完全降解，吸水率为自重的60倍以上。

优选地，所述步骤1是将盐析后胶原纤维用纯化液进行重溶，使用切向流过滤技术对胶原进行纯化、浓缩，此过程在4~13℃温度下进行。

优选地，所述步骤1纯化过程中结合搅拌及纯化液的补给，使得胶原能够顺利的进行纯化。

优选地，所述步骤1中，所述盐析后胶原纤维重溶后的浓度为0.5~8mg/mL。

优选地，所述步骤1中，纯化时选用改性聚醚砜中空纤维过滤管的截留分子量为50~100KD，最终进行胶原浓缩时选用改性聚醚砜中空纤维过滤管的孔径为0.1~1µm；在2~4h内实现胶原溶液的纯化。

作为优选，所述步骤1中，纯化液选用0.01M~0.5M醋酸溶液。

所述步骤2中，所述胶原溶液的浓度为1~5mg/mL，pH为2.0~3.5；所述生物缓冲液pH为7.2~7.5；分子自组装于30±0.5℃孵育30~90min。

优选地，所述步骤2中，所述胶原溶液的浓度为1~5mg/mL，pH为2.0~3.5。

优选地，所述步骤2中，所述生物缓冲液包括如HEPES、PBS、TES等中的至少一种，pH为7.2~7.4。

优选地，所述步骤2中，所述交联剂包括甲醛、戊二醛、改性戊二醛、碳化二亚胺中的至少一种。

优选地，所述步骤3中，离心速度为6000~12000rpm，20~30℃下离心3~30min。

优选地，所述步骤4具体为：将步骤3获得的浑浊液混合均匀后，装入模具中，继续升温至35~37℃，凝胶化30min~90min。

优选地，所述步骤5中，具体包括以下工艺：

1）-80℃快速冷冻，解冻，水洗；其中解冻是在室温下进行缓慢解冻；