[发明专利]粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法

说明书

本发明公开了一种粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，包括以下步骤：a）将待测粗品肝素钠溶于含有氯化钠和乙醇的水溶液中，再加入生物磁珠，通过磁珠法提取粗品肝素钠中的总DNA，b）设计猪、羊、牛源性成分鉴别引物；c）以待测粗品肝素钠总DNA为模板，采用猪、羊、牛源性成分鉴别引物分别进行PCR扩增；d）将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，根据得到的特异性条带分子量大小来判断该待测粗品肝素钠的种属来源。本发明提供的鉴别方法可有效解决传统方法中存在的肝素对PCR抑制的问题，而且大大降低了成本，方法简洁明了，快速简便，重复性好，易操作，准确性高，适于在粗品肝素钠种属来源鉴别中推广应用。

技术领域

本发明涉及药物来源检测方法，具体地说是一种粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法。

背景技术

肝素钠是黏多糖硫酸酯类物质，因其具有抗凝血作用，广泛应用于血栓形成或栓塞性疾病的临床治疗。近年来研究证明，肝素钠还具有降血脂作用。目前，肝素钠主要来源于猪、牛或羊的肠黏膜。但是，牛源性和羊源性的肝素钠存在被相关病毒感染的风险，且导致血小板减少症及血栓综合征等不良反应的发生概率要远远大于猪源性肝素钠。因此，在临床使用中人们会应尽量选择猪源性肝素钠。然而，实际生产中由于生产材料来源复杂等多方面原因，往往会导致猪来源的生产原料存在被牛、羊等来源的动物材料污染的可能性。因此，建立猪源、羊源、牛源等动物来源成分的鉴别方法对控制药品质量、防止异种动物源性成分的污染至关重要。

目前，现有技术中检测不同种属来源的肝素钠的方法主要有免疫化学和核酸检测等。其中荧光定量PCR方法核酸检测使用相对更为广泛，具体是先从粗品肝素钠中提取动物残留核酸，再采用荧光定量PCR进行检测。荧光定量PCR技术是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。这种检测方法结果较为精准，但是这种方法检测肝素钠时存在一定缺陷，因为肝素对PCR有很强的抑制活性，所以在做定量PCR前需要使用肝素酶对肝素钠样品进行前处理，其操作复杂繁琐、肝素酶和定量试剂费用高昂，这使得该方法在技术力量薄弱的中小企业使用受到了很大的局限。可见，研发成本低、操作便捷、准确度高的不同种属来源的肝素钠的鉴别方法是行业内积极探索的课题。

发明内容

本发明的目的是提供一种粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，以解决现有检测方法要么无法控制肝素对后期PCR的抑制导致检测准确性降低，要么前处理操作繁琐复杂、成本较高的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，包括以下步骤：

（a）将待测粗品肝素钠溶于溶剂A中，再加入生物磁珠，通过磁珠法提取粗品肝素钠中的总DNA，得待测粗品肝素钠总DNA；所述溶剂A为每100mL水中溶解有2g氯化钠和10g乙醇的混合溶液；所述粗品肝素钠、溶剂A、生物磁珠的质量体积比为30mg:1mL:30μL；

（b）设计猪、羊、牛源性成分鉴别引物分别为：

猪源性成分鉴别引物：

上游引物：ATCTACATGATTCATTACAATTAC，

下游引物：CTATGTTTTTGAGTTTTGAGTTCA；

羊源性成分鉴别引物：

上游引物：ACACAACTTCTACCACAACCC，

下游引物：AAACAATGAGGGTAACGAGGG；

牛源性成分鉴别引物：

上游引物：GCCATATACTCTCCTTGGTGACA，

下游引物：GTAGGCTTGGGAATAGTACGA；