[发明专利]粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法

权利要求书

1.一种粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）将待测粗品肝素钠溶于溶剂A中，再加入生物磁珠，通过磁珠法提取粗品肝素钠中的总DNA，得待测粗品肝素钠总DNA；所述溶剂A为每100mL水中溶有2g氯化钠和10g乙醇；所述粗品肝素钠、溶剂A、生物磁珠的质量体积比为30mg:1mL:30μL；

（b）设计猪、羊、牛源性成分鉴别引物分别为：

猪源性成分鉴别引物：

上游引物：ATCTACATGATTCATTACAATTAC，

下游引物：CTATGTTTTTGAGTTTTGAGTTCA；

羊源性成分鉴别引物：

上游引物：ACACAACTTCTACCACAACCC，

下游引物：AAACAATGAGGGTAACGAGGG；

牛源性成分鉴别引物：

上游引物：GCCATATACTCTCCTTGGTGACA，

下游引物：GTAGGCTTGGGAATAGTACGA；

（c）以步骤（a）所得待测粗品肝素钠总DNA作为DNA模板，采用步骤（b）设计的猪、羊、牛源性成分鉴别引物分别进行PCR扩增，其扩增体系为：DNA模板3μL、上游引物 1μL、下游引物1μL、2倍浓度PCR试剂预混液 25μL，用ddH₂O补齐至50μL；

PCR反应程序为：在95℃下预变性5min；在95℃下变性15s；在63℃下退火30s；在72℃下延伸30s；热循环40次；得扩增产物；

（d）将所述扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，如得到了分子量大小为150bp的特异性条带，则表明该待测粗品肝素钠中含有猪源性肝素钠成分；如获得了分子量大小为145bp的特异性条带，则表明该待测粗品肝素钠中含有羊源性肝素钠成分；如获得了分子量大小为271bp的特异性条带，则表明该待测粗品肝素钠中含有牛源性肝素钠成分。

2.根据权利要求1所述的粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，其特征在于，步骤（a）所述的通过磁珠法提取粗品肝素钠中的总DNA的具体步骤是：①将加入生物磁珠的待测粗品肝素钠溶液置于离心管中振荡10s，置于室温孵育10min，振荡；②将离心管放置于磁力架上静置1min，除去液体；③将离心管从磁力架上取下，加入6倍生物磁珠体积的漂洗液A，振荡混匀1min；④将离心管放置于磁力架上静置1min，除去液体；⑤将离心管从磁力架上取下，再加入6倍生物磁珠体积的漂洗液B，振荡混匀1 min；⑥将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，去除液体；⑦ 重复步骤⑤-⑥一次；⑧再将离心管置于磁力架上，56℃晾干5-10 min；⑨将离心管从磁力架上取下，加入20μL的TE缓冲液，56℃振荡混匀5 min；⑩将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附后，分离得到的DNA即为待测粗品肝素钠总DNA。

3.根据权利要求2所述的粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，其特征在于，所述漂洗液A为每1L水中溶有0.8mol的LiCl、0.5mol的NaCl和200g的PEG，其pH值为7.0；所述漂洗液B为质量百分比浓度为80%的乙醇。

4.根据权利要求1所述的粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，其特征在于，步骤（c）中所述的2倍浓度PCR试剂预混液是指：Tris-HCl 20mmol/L、dNTP 0.4mmol/L、KCl100mmol/L、MgCl₂ 3mmol/L，taq酶 0.05U/μL。

5.根据权利要求1所述的粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，其特征在于，步骤（d）中所述扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳的具体工艺为：取20μL所述扩增产物加入上样缓冲液2μL，采用质量百分比浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳20min。