[发明专利]一种马驽巴贝斯虫病荧光PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR标量阳性对照建立的马驽巴贝斯虫病检测试剂盒，用于马属动物感染马驽巴贝斯虫病的临床诊断和日常监测。

背景技术

马驽巴贝斯虫病是由马驽巴贝斯虫(Babesiacaballi)寄生于马属动物红细胞内所引起的一种血液原虫病，病畜多表现为贫血、黄疸、高热稽留、厌食、消瘦等临床症状。本病尤其对出入境动物危害严重，被OIE列为B类疫病。目前，市面上流通的治疗马驽巴贝斯虫病的药物效果一般，由于新疆特殊的地理环境条件，媒介蜱分布广而多，该病的发病率在我区(新疆)呈逐年上升趋势，严重影响了马产业的发展。因此，为了综合防治该病在我区发生和流行，必先建立特异性强、检出率高的诊断方法及时进行检疫马，故马驽巴贝斯虫病荧光PCR快速检测试剂盒的研制是我区兽医工作者努力研究、亟待解决的新课题之一。

目前，对马驽巴贝斯虫病诊断方法大致可分为病原体显微镜检测方法、血清学诊断方法和分子生物学技术诊断方法。基层疫病监测部门该病的诊断仍停留在传统的镜检法，且受到制片与染色技术等多种因素的影响，易造成漏诊和误诊，特别是相似形态虫体的鉴别诊断以及大规模的流行病学调查较为困难。常规血清学诊断方法存在着抗原来源不足、敏感性和特异性较差等问题，且马驽巴贝斯虫体外培养尚未成功。所以在我区，每年的3～7月份，大量马因马驽巴贝斯虫病死亡，故唯一可行的，是借鉴流行病学研究，创建实用、简便、经济、灵敏度高的新诊断体系。荧光PCR检测技术作为一种较新的检测方法，尤其是目前在动物疾病研究领域应用十分广泛。与普通PCR技术相比较，实时荧光定量PCR技术的优势十分显著：操作简便，无需在扩增后进行凝胶电泳成像；由于省去了开盖后出现的二次污染，使得该技术出现假阳性的几率大大降低；通过计算机系统的介入，该方法可以对扩增过程进行实时定量监控，可对扩增产物进行准确的定量分析。荧光定量PCR原理是将荧光物质或具有荧光信号的特异性探针通过与靶基因的特异性结合，仪器实时监控每一个封闭的PCR反应，系统软件根据荧光信号的强弱自动绘制反应曲线，从而对整个PCR反应过程的荧光信号的增减进行实时监测。在荧光定量PCR技术中，值得了解的是Ct值，其中的C所代表的含义为Cycle，t所代表的含义为threshold，表示每个扩增反应达到阈值时所经历的循环数，每个样本的初始拷贝数与Ct值成线性相关，所以当Ct值很小时，就表示起始拷贝数很多。因此，当我们利用确定的标准品即可绘制出该标准品的标准曲线，由于特异性探针的所发出的报告基团荧光强度与PCR扩增产物数量表现为线性相关，当获知待测样本的Ct值后，就可从根据标准曲线计算出该样品的起始拷贝数，实现定量分析。