[发明专利]一种阿胶中驴、猪源性巢式荧光PCR检测引物、探针组合物、试剂盒及检测方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种胶类中药动物源性检测技术领域，具体涉及一种阿胶中驴、猪源性巢式荧光PCR检测引物、探针组合物、试剂盒及检测方法与应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

阿胶为马科动物驴的皮，经煎煮、浓缩制成的固体胶，原产自山东省泛东阿区，始载于《神农本草经》，与人参、鹿茸并称为“滋补三宝”，至今已有近三千年历史。阿胶补血圣药，味甘平，入肺、肝、肾经，具有补血止血、滋阴润燥等功效，药食两用，长期服用可补血养血、美白养颜、抗衰老、抗疲劳、提高免疫力，适用人群广泛。李时珍著《本草纲目》载：“阿胶《本经》上品。

2015版《中国药典》明确规定阿胶为马科动物驴(EquusanimusL.)的皮熬制而成的阿胶为正品阿胶。然而随着胶类市场的不断发展，随着熬胶原料供应紧张和价格上涨，由于阿胶功效独特，市场供不应求，掺假伪劣产品层出不穷，并不断被媒体曝光。这些劣质阿胶多采用牛、马、骡子、猪、羊等动物皮、骨、结缔组织熬制，用肉眼难以鉴别，《中国药典》通过驴的特征态测驴源成分，已不能满足鉴别杂皮源的需求。伪劣阿胶在临床使用后不仅达不到治疗效果，还对消费者健康安全带来巨大隐患。为了取缔和预防假冒伪劣阿胶产品，需要质量监管部门加大执法力度，而首要前提是具备科学可靠的检测方法。

传统的巢式PCR反应由于有2次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶点的可能性，增加了检测的灵敏度和可靠性，主要应用于分子生物学领域和医学检测研究中。但也有耗时长、易污染和假阳性等缺点，即从PCR扩增开始全程耗时约5h，检测结果需要电泳及凝胶成像系统才能看到结果，多次开管操作，交叉污染的可能性大。

此外，由于阿胶经过多个工序的高温煎煮，导致线性基因组DNA断裂成小片段，甚至降解掉，虽然环状线粒体DNA对高温的耐受力相对线性基因组DNA较强，但阿胶经过深度加工后都会对DNA不同程度的破坏，如何解决降解DNA成为基于DNA检测技术来检测阿胶真伪的一大瓶颈。中国专利(CN104988231.A)利用半巢式PCR技术鉴别阿胶真伪，扩增片段700bp左右，对于深度加工的胶类中药来将，DNA已高度破坏，大片段扩增很难成功，加上需要两轮PCR扩增，不但耗时、开管操作极易造成交叉污染导致假阳性及结果的准确性低，所以传统PCR检测方法已经不能满足当前阿胶真伪检测的要求。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种阿胶中驴、猪源性多重巢式荧光PCR(Mini-NEST-MultipleqPCR)检测引物、探针组合物、试剂盒及检测方法与应用，该试剂盒检测灵敏度高、特异性好，可以实现阿胶中驴、猪源性成分快速定性检测；该检测方法(Mini-NEST-MultipleqPCR)快速简便、准确度高。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：

一种同时鉴别阿胶中驴、猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测引物、探针组合物，包括：

(1)多重巢式荧光PCR检测驴、猪源性通用外侧引物，其扩增片段为202bp，其核苷酸序列如下：

正向引物序列：5'CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA3'，如SEQNO.1所示；

反向引物序列：5'TCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCC3'，如SEQNO.2所示；

(2)多重巢式荧光PCR检测驴、猪源性通用内侧引物，，其扩增片段为143bp，其核苷酸序列如下：

正向引物序列：5'TATGAGTAACAAGAATTATTTCTCC3'，如SEQNO.3所示；

反向引物序列：5'AGCCTGTGTTGGGTTAACAA3'，如SEQNO.4所示；

(3)驴特异性探针，其核苷酸序列如下：

5'CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT3'，如SEQNO.5所示；

(4)猪特异性探针，其核苷酸序列如下：

5'CTCCTCGCACACGCTTACATCAGTA3'，如SEQNO.6所示；

其中，所述驴、猪特异性探针的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。

本发明还可以具有以下附加技术特征：

进一步的，驴特异探针序列(SEQNO:5)为：

5'JOE-CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT-BHQ23'；