[发明专利]一种阿胶中驴、猪源性巢式荧光PCR检测引物、探针组合物、试剂盒及检测方法与应用

权利要求书

1.一种同时鉴别阿胶中驴、猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测引物、探针组合物，其特征在于，包括：

(1)多重巢式荧光PCR检测驴、猪源性通用外侧引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列：5'CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA3'，如SEQNO.1所示；

反向引物序列：5'TCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCC3'，如SEQNO.2所示；

(2)多重巢式荧光PCR检测驴、猪源性通用内侧引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列：5'TATGAGTAACAAGAATTATTTCTCC3'，如SEQNO.3所示；

反向引物序列：5'AGCCTGTGTTGGGTTAACAA3'，如SEQNO.4所示；

(3)驴特异性探针，其核苷酸序列如下：

5'CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT3'，如SEQNO.5所示；

(4)猪特异性探针，其核苷酸序列如下：

5'CTCCTCGCACACGCTTACATCAGTA3'，如SEQNO.6所示；

其中，所述驴、猪特异性探针的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。

2.根据权利要求1所述的同时鉴别阿胶中驴、猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测引物、探针组合物，其特征在于，还包括内标质控体系，所述内标质控体系包括质控体系引物、质控体系探针和质控体系序列，各核苷酸序列如下：

(1)质控体系引物：

上游引物序列如SEQNO.1所示，下游引物如SEQNO.2所示；

(2)质控体系探针：

CntP：5'TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT3'，如SEQNO.7所示；

(3)质控体系序列：

CCTGTATCAACACATAGAAGCAATATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTCGGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGA，如SEQNO.8所示；

其中，质控体系探针的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，所述报告基团为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任一种。

3.一种同时鉴别阿胶中驴、猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的同时鉴别阿胶中驴、猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测引物、探针组合物，以及阿胶DNA提取液和多重巢式荧光PCR反应所需试剂。

4.根据权利要求3所述的同时鉴别阿胶中驴、猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括驴、猪阳性标准品、阴性对照品和空白对照品。

5.根据权利要求3或4所述的同时鉴别阿胶中驴、猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重巢式荧光PCR反应所需试剂包括：多重巢式荧光PCR反应缓冲液2×qPCRMasterMix，Taq热启动酶，镁离子浓度2.0mM，4种dNTP的终浓度各为200μM，Tris-H2SO4pH9.0终浓度为300mM，KCl终浓度为600mM，终浓度为5M/L的甜菜碱和超纯水；所述试剂盒为20μlPCR反应扩增体系：2×qPCRMasterMix10μl，外侧引物对10μM取0.5μl，内侧引物对10μM取1μl，探针用量10μM取0.5μl，DNA用量1-50ng/μl取2μl，用双蒸水补足20μl。

6.根据权利要求5所述的同时鉴别阿胶中驴、猪源性成分的多重巢式荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR扩增步骤为两步：第一步反应外侧引物优先扩增，反应条件为95℃10min，95℃10s，70℃，35s，在此收集荧光信号，15个循环；第二步反应内侧引物优先扩增，反应条件为95℃10s，60℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环。