[发明专利]基因工程生物指示剂

说明书

技术领域

本发明涉及属于消毒灭菌生物指示剂领域，尤其涉及用于一种或多种灭菌效力且用于生物监测的一种基因工程生物指示剂。

背景技术

在医疗保健行业，卫生检疫行业，制药企业等多种涉及无菌技术的行业，常常有必要对各种无菌生产工艺、 无菌产品、 无菌包装材料等灭菌效果进行评估验证，检测设备的灭菌效力。世界各地每年都会有因灭菌不彻底导致感染事件发生的报道。生物检测即是通过标准化的菌株，其合乎要求的抗力来考核灭菌负荷是否达到无菌保障水平的要求。

目前国内外广泛使用的生物指示剂为通用型生物指示剂和快速型生物指示剂。通用型生物指示剂是依据芽胞恢复生长时，新陈代谢产生酸性代谢产物引起培养基pH变化，通过添加pH指示剂如溴甲酚紫，根据其颜色变化来判读结果。微生物培养时间为24h~48h。通用型生物指示剂结果可靠，但耗时较久，无法达到快速判读的标准，在临床应用中有极大的限制。快速型生物指示剂，主要依据芽胞恢复生长时产生的α-葡萄糖苷酶，水解底物产生荧光物质，通过检测荧光强度的变化判读灭菌结果。α-葡萄糖苷酶是芽胞恢复生长所必须的水解酶，存在于芽胞外壁中，营养细胞中也有该酶存在。通过对酶水解底物产生的荧光物质进行检测，可达到在1h~3h内读取结果，进而缩短读取到灭菌失败的结果的时间。但是由于通过间接检测酶的性质，来判读结果，而研究发现该酶的耐热性比芽胞更强。因此导致芽胞已灭活而酶依旧存在并保持其活力的情况发生。

基因工程生物指示剂通过直接检测基因水平的表达，来确定灭菌结果。该方法直接检测芽胞的生命状态，可有效解决酶与芽胞活力状态不一致的问题。US8372624B2专利公开了一种基因工程生物指示剂，该生物指示剂携带有阻遏基因和报告基因。当微生物暴露于诱导剂中时，报告基因表达，转录翻译出指示酶。指示酶与特异性酶底物作用，产生荧光物质进行检测。传统的报告基因如CAT氯霉素乙酰转移酶，beta-Gal，beta-半乳糖苷酶等，由于其本身不能发光，需添加特异性酶底物，才可检测到报告基因的表达。应用此类报告基因同时也存在酶底物透膜速率慢，荧光强度与酶活力关系密切等缺点。而荧光蛋白家族在成熟蛋白质形成后，可自发荧光，无需同特异性酶底物作用，即可进行荧光光强检测，来判断灭菌结果。US8372624 B2专利也公开了以GFP绿色荧光蛋白作为报告基因的基因工程生物指示剂。野生型绿色荧光蛋白GFP，缺乏酶促放大作用，荧光信号相对较弱，灵敏度较低。

WO2014149379 A1专利在上述专利的基础上，减少阻遏基因，来降低基因工程生物指示剂的复杂性。若减少阻遏基因，则该基因在非诱导情况下也会表达，同样也会存在酶的耐热性与芽胞耐热性不一致的现象的发生。

发明内容

本发明目的在于针对上述存在的问题与不足，提供一种基因工程生物指示剂，以无害，高灵敏度的一种或多种突变体荧光蛋白作为报告基因，上游采用高转录活性诱导型启动子，诱导型启动子上游添加选择性标记基因对菌株进行筛选。

本发明通过基因工程技术手段将上述外源基因导入指示微生物中，外源基因包括启动子，报告基因和选择性标记基因。选择性标记基因位于诱导型启动子上游，报告基因位于诱导型启动子下游。在无诱导物存在下，选择性标记基因表达，报告基因无表达，用于筛选转染成功的菌株。经过灭菌因子暴露后，指示微生物同诱导物相接触，报告基因表达。

本发明中基因工程生物指示剂在诱导物的存在下，从启动子处开始转录及翻译，表达出报告基因。此类报告基因具有独特的优异性，无需特异性酶底物，可自发荧光，同时也具有较高的性噪比，荧光信号强，易检测，灵敏度高等优点。诱导型启动子的存在，保证基因在非诱导情况下无表达，防止生物体在灭菌之前表达荧光蛋白，蛋白质与芽胞不同的抗热性能影响灭菌后结果的判读。

为达成上述发明目的，本发明的技术方案如下：一种基因工程生物指示剂，其包括：

菌片，其均匀分布有指示微生物；

内层包装，其确保菌片在保存时处于无菌环境，同时在灭菌过程中有效灭菌因子同菌片接触；

安瓿瓶，其内部密封有芽胞生长培养基和诱导物，其中芽胞生长培养基和诱导物在灭菌过程中与菌片分开，而在灭菌结束后允许同菌片接触。

在上述技术方案的基础上，进一步包括如下附属技术方案：

所述指示微生物包括嗜热脂肪芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，短小芽胞杆菌，生孢梭菌，枯草芽胞杆菌黑色变种芽胞中的一种或多种。

所述指示微生物为细菌芽胞。

所述指示微生物为经过基因工程改造的指示微生物。