[发明专利]蛋清中硫酸角质素的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种硫酸角质素的提取方法，尤其涉及一种从蛋清中提取硫酸角质素的方法。

背景技术

硫酸角质素是一类糖胺聚糖，即富含阴离子的直链线性大分子多糖。和其它糖胺聚糖一样，动物体内硫酸角质素能够和多种细胞生长因子、细胞因子、细胞受体以及生化酶相结合，诱发信号转导、调控细胞生长、分化及凋亡；此外还调控组织器官中含水量。目前硫酸角质素主要被研制成药物用于眼科疾病治疗，如眼睛炎症、眼睛色素膜炎、眼角膜炎、眼角膜损伤；之外也作为滴眼液主要成分用于眼保健。

目前硫酸角质素主要来自牛眼角膜，产量有限，加上疯牛病的爆发，市场上硫酸角质素产品尤其缺乏。

发明内容

本发明提供一种从蛋清中硫酸角质素的提取方法，可有效解决上述问题。

一种蛋清中硫酸角质素的提取方法，其特征在于，包括：

S1，获取蛋清；

S2，往所述蛋清中加入链霉蛋白酶～Actinase E，并保持反应温度为37～39℃，处理12～28小时以降解所述蛋清中的蛋白质；

S3，将步骤S2中的链霉蛋白酶～Actinase E灭活；

S4，将步骤S3中获得的产物用蛋白酶K或碱性蛋白酶～alcalase在53～56℃温度下处理6～24小时以进一步降解所述蛋清中残余的蛋白质以及灭活的链霉蛋白酶～Actinase E；

S5，将步骤S4中的蛋白酶K或碱性蛋白酶～alcalase灭活；

S6，将步骤S5所获得的产物离心分离，获取上清液；

S7，从步骤S6获得的上清液中提取总糖胺聚糖；

S8，将从步骤S7获得的总糖胺聚糖溶解于水，然后加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III于37℃反应12～24小时以降解总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素，然后加入硫酸软骨素酶反应液以及硫酸软骨素酶III、硫酸软骨素酶II于37℃反应8～24小时以降解总糖胺聚糖中的硫酸软骨素/硫酸皮肤素以及透明质酸；

S9，将从步骤S8获得的产物循环两遍加入强效阴离子交换柱(循环两遍加样可以有效提高硫酸角质素与阴离子交换柱的结合，从而提高硫酸角质素产率)，或往所述上清液中加入强碱性阴离子交换树脂结合过夜，上清液与树脂体积比为5～80：1；用0.1～0.5M的NaCl洗涤所述强效阴离子交换柱或所述强碱性阴离子交换树脂以去除酶解后的糖链碎片或其它杂质，再用3.3M的NaCl洗脱获得硫酸角质素盐溶液；随后，或者用截留量为3～10kDa的超滤管或透析袋洗脱NaCl获得硫酸角质素；或者先用2～5倍体积的甲醇加入硫酸角质素盐溶液，在-20～8℃沉淀硫酸角质素12～18小时，离心，弃含盐上清，之后用体积浓度70～95v％甲醇洗涤硫酸角质素沉淀；最后冻干或空干获得最终产物硫酸角质素。

优选的，步骤S2中，所述链霉蛋白酶～Actinase E与所述直接从蛋中分离的液态蛋清的质量比1:50～300。

优选的，步骤S2中，所述冷冻干燥的蛋清或烘干后粉碎的蛋清，先用水或磷酸盐缓冲液溶解，水或PBS与干燥蛋清的质量比为10～50：1，之后加入所述链霉蛋白酶～Actinase E，酶与干燥蛋清的质量比1:20～100。

优选的，将步骤S2中的链霉蛋白酶～Actinase E灭活包括：将步骤S2获得的产物在90～95℃加热处理10～30分钟。

优选的，步骤S4中，所述蛋白酶K与链霉蛋白酶～Actinase E的质量比1：5～15，所述碱性蛋白酶～alcalase与链霉蛋白酶～Actinase E的质量比1：5～20。

优选的，将步骤S4中的蛋白酶K或碱性蛋白酶～alcalase灭活包括：将步骤S4获得的产物在90～100℃加热处理10～40分钟。

优选的，在步骤S6中，所述将步骤S5所获得的产物离心分离，通过悬浮桶转子3200～8000xg离心力实现。