[发明专利]蛋清中硫酸角质素的提取方法

权利要求书

1.一种蛋清中硫酸角质素的提取方法，其特征在于，包括：

S1，获取蛋清；

S2，往所述蛋清中加入链霉蛋白酶～Actinase E，并保持反应温度为37～39℃，处理12～28小时以降解所述蛋清中的蛋白质；

S3，将步骤S2中的链霉蛋白酶～Actinase E灭活；

S4，将步骤S3中获得的产物用蛋白酶K或碱性蛋白酶～alcalase在53～56℃温度下处理6～24小时以进一步降解所述蛋清中残余的蛋白质以及灭活的链霉蛋白酶～Actinase E；

S5，将步骤S4中的蛋白酶K或碱性蛋白酶～alcalase灭活；

S6，将步骤S5所获得的产物离心分离，获取上清液；

S7，从步骤S6获得的上清液中提取总糖胺聚糖；

S8，将从步骤S7获得的总糖胺聚糖溶解于水，然后加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III于37℃反应2～16小时以降解总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素，然后加入硫酸软骨素酶反应液以及硫酸软骨素酶III、硫酸软骨素酶II于37℃反应8～24小时以降解总糖胺聚糖中的硫酸软骨素/硫酸皮肤素以及透明质酸；

S9，将从步骤S8获得的产物加入强效阴离子交换柱，或往产物中加入强碱性阴离子交换树脂结合过夜，上清液与树脂体积比为5～80：1；之后用0.1～0.5M的NaCl洗涤所述强效阴离子交换柱或所述强碱性阴离子交换树脂以去除结合不紧密的酶解后的糖链碎片或其它杂质，再用3.3M的NaCl洗脱获得硫酸角质素盐溶液；随后，或者用截留量为3～10kDa的超滤管或透析袋脱盐去除NaCl获得硫酸角质素；或者先用2～5倍体积的甲醇加入硫酸角质素盐溶液，在-20～8℃沉淀12～18小时，离心，弃含盐上清，之后用体积浓度70～95v％甲醇洗涤硫酸角质素沉淀；最后冻干或空干获得最终产物硫酸角质素。

2.根据权利要求1所述的蛋清中硫酸角质素的提取方法，其特征在于，步骤S2中，所述链霉蛋白酶～Actinase E与直接从蛋中分离的液态蛋清的质量比1:50～300。

3.根据权利要求1所述的蛋清中硫酸角质素的提取方法，其特征在于，步骤S2中，冷冻干燥的蛋清或烘干后粉碎的蛋清，先用水或磷酸盐缓冲液PBS溶解，水或PBS与干燥蛋清的质量比为10～50：1，之后加入链霉蛋白酶～Actinase E，酶与干燥蛋清的质量比1：20～100。

4.根据权利要求1所述的蛋清中硫酸角质素的提取方法，其特征在于，将步骤S2中的链霉蛋白酶～Actinase E灭活包括：将步骤S2获得的产物在90～95℃加热处理10～30分钟。

5.根据权利要求1所述的蛋清中硫酸角质素的提取方法，其特征在于，步骤S4中，所述蛋白酶K与链霉蛋白酶～Actinase E的质量比1：5～15，所述碱性蛋白酶～alcalase与链霉蛋白酶～Actinase E的质量比1：5～20。

6.根据权利要求1所述的蛋清中硫酸角质素的提取方法，其特征在于，将步骤S4中的蛋白酶K或碱性蛋白酶～alcalase灭活包括：将步骤S4获得的产物在90～100℃加热处理10～40分钟。

7.根据权利要求1所述的蛋清中硫酸角质素的提取方法，其特征在于，在步骤S6中，所述将步骤S5所获得的产物离心分离，通过悬浮桶转子3200～8000xg离心力实现。

8.根据权利要求1所述的蛋清中硫酸角质素的提取方法，其特征在于，步骤S7包括：将所述上清液加入强效阴离子交换柱，或往所述上清液中加入强碱性阴离子交换树脂结合过夜，上清液与树脂体积比为5～80：1；之后用0.1～0.5M的NaCl洗涤所述强效阴离子交换柱或所述强碱性阴离子交换树脂以充分洗掉杂蛋白或其它杂质，随后用3.3M的NaCl洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液；之后，或者用截留量为3～10kDa的超滤管或透析袋去除NaCl获得总糖胺聚糖；或者先用2～5倍体积的甲醇加入总糖胺聚糖盐溶液，在-20～8℃温度下沉淀总糖胺聚糖12～18小时，然后离心去除含盐上清，之后用体积浓度95％甲醇连续多次洗涤总糖胺聚糖沉淀；将所述总糖胺聚糖产物冻干或空干。