[发明专利]眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法

说明书

技术领域

本发明属于蛇毒神经生长因子制备领域，尤其涉及一种眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法。

背景技术

神经生长因子(Nervegrowthfactor，NGF)是神经系统重要的营养成分，在保证神经系统正常的功能中发挥着重要的作用，另外，NGF还与内分泌、免疫、生殖系统、老年痴呆症等有密切的关联。其主要作用有四方面：<1>在机体发育过程中促使神经系统生长发育；<2>在机体成熟后对正常神经细胞有营养保护作用；<3>神经损伤(如脑血管意外和脑外伤)后可促使神经元再生和功能恢复；<4>提高学习和记忆功能。

眼镜蛇毒神经生长因子作为药物的主要活性成分，其疗效好、起效快、安全有效、毒副作用小，是预防和治疗神经系统疾病的理想药物。现有的眼镜蛇毒NGF分离纯化主要采用凝胶柱层析法与离子交换层析法的组合，并在分离纯化后采用PC12细胞法、双向免疫扩散法或SDS-PAGE电泳法等方法对所分离结果进行验证，但由于柱效的影响因素繁多，且很难加以控制，故此类方法的重复性差，得到的NGF的活性较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简单、高效、可控的眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法，先采用DEAECL-6B阴离子交换柱然后再利用SephadexG-50凝胶层析柱、Macro-prepHighS阳离子交换柱依次进行分离，每次分离后选取蛇毒神经生长因子活性最高的峰作为下步分离的样品。

选取蛇毒神经生长因子活性最高的峰采用PC12细胞检验法，用超纯水对所收集的各峰稀释后进行检验。

稀释倍数为10倍、100倍、1000倍、10000倍。

上述眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法，包括以下步骤：

(1)DEAECL-6B阴离子交换柱洗脱分离；

(2)SephadexG-50凝胶层析柱洗脱分离；

(3)Macro-prepHighS阳离子交换柱洗脱分离。

步骤(1)按以下操作进行：将DEAECL-6B柱用缓冲液A平衡8h，再将配制好的样品上样于平衡好的柱子，采用缓冲液B按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各峰，采用PC12细胞检验法对各峰蛇毒神经生长因子活性进行测定，选取活性最高的峰冻干，备用；缓冲液A为0.05M的Tris-HCl缓冲液，pH8.5；缓冲液B为0.5M的NaCl溶液，pH8.5。

样品的配制按以下操作进行：称取眼镜蛇毒冻干粉1g，加入10ml平衡缓冲液，4℃溶解4h；待溶解完全后，8000rpm，4℃离心15min；取上清液，先过0.45μm滤膜，再过0.22μm滤膜后，备用；平衡缓冲液为0.05M的Tris-HCl缓冲液，pH8.5。

步骤(2)按以下操作进行：将步骤(1)中活性最高峰的冻干粉，加5mlPB缓冲液充分溶解后，上样于PB缓冲液平衡好的G-50凝胶柱，采用PB缓冲液按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各峰，采用PC12细胞检验法对各峰蛇毒神经生长因子活性进行测定，选取活性最高的峰冻干，备用；PB缓冲液为0.02M的磷酸二氢钠和0.02M的磷酸氢二钠按比例137∶63混合配制而成的缓冲液，混合后缓冲液pH为6.5。

步骤(3)按以下操作进行：将步骤(2)中活性最高峰的冻干粉，加1mlPB缓冲液充分溶解后，10000rpm离心15min，取上清液，过0.22μm滤膜后，上样于PB缓冲液平衡好的Macro-prepHighS柱，采用缓冲液B按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各峰，采用PC12细胞检验法对各峰蛇毒神经生长因子活性进行测定，选取活性最高的峰冻干，于-20℃冰箱中保存；溶解用的PB缓冲液为0.02M，pH4.0；平衡用的PB缓冲液为0.02M，pH6.5；缓冲液B为0.5M的NaCl溶液，pH6.5。(注：溶解用的PB缓冲液是将平衡用的PB缓冲液中加入少量醋酸，调节pH至4.0；平衡用的PB缓冲液为0.02M的磷酸二氢钠和0.02M的磷酸氢二钠按比例137∶63混合配制而成的缓冲液，混合后缓冲液pH为6.5。)

PC12细胞检验法按以下操作进行：用超纯水对所收集的各峰分别稀释10倍，100倍，1000倍，10000倍后加入含有PC12细胞的48孔板，于72h后观察细胞状态。