[发明专利]眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法

权利要求书

1.一种眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法，其特征在于：先采用DEAECL-6B阴离子交换柱然后再利用SephadexG-50凝胶层析柱、Macro-prepHighS阳离子交换柱依次进行分离，每次分离后选取蛇毒神经生长因子活性最高的峰作为下步分离的样品。

2.根据权利要求1所述的眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法，其特征在于所述选取蛇毒神经生长因子活性最高的峰采用PC12细胞检验法，用超纯水对所收集的各峰稀释后进行检验。

3.根据权利要求3所述的眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法，其特征在于所述稀释倍数为10倍、100倍、1000倍、10000倍。

4.根据权利要求1所述的眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)DEAECL-6B阴离子交换柱洗脱分离；

(2)SephadexG-50凝胶层析柱洗脱分离；

(3)Macro-prepHighS阳离子交换柱洗脱分离。

5.根据权利要求1所述的眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法，其特征在于步骤(1)按以下操作进行：将DEAECL-6B柱用缓冲液A平衡8h，再将配制好的样品上样于平衡好的柱子，采用缓冲液B按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各峰，采用PC12细胞检验法对各峰蛇毒神经生长因子活性进行测定，选取活性最高的峰冻干，备用；所述缓冲液A为0.05M的Tris-HCl缓冲液，pH8.5；所述缓冲液B为0.5M的NaCl溶液，pH8.5。

6.根据权利要求1所述的眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法，其特征在于所述样品的配制按以下操作进行：称取眼镜蛇毒冻干粉1g，加入10ml平衡缓冲液，4℃溶解4h；待溶解完全后，8000rpm，4℃离心15min；取上清液，先过0.45μm滤膜，再过0.22μm滤膜后，备用；所述平衡缓冲液为0.05M的Tris-HCl缓冲液，pH8.5。

7.根据权利要求1所述的眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法，其特征在于步骤(2)按以下操作进行：将步骤(1)中活性最高峰的冻干粉，加5mlPB缓冲液充分溶解后，上样于PB缓冲液平衡好的G-50凝胶柱，采用PB缓冲液按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各峰，采用PC12细胞检验法对各峰蛇毒神经生长因子活性进行测定，选取活性最高的峰冻干，备用；所述PB缓冲液为0.02M的磷酸二氢钠和0.02M的磷酸氢二钠按比例137∶63混合配制而成的缓冲液，混合后缓冲液pH为6.5。

8.根据权利要求1所述的眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法，其特征在于步骤(3)按以下操作进行：将步骤(2)中活性最高峰的冻干粉，加1mlPB缓冲液充分溶解后，10000rpm离心15min，取上清液，过0.22μm滤膜后，上样于PB缓冲液平衡好的Macro-prepHighS柱，采用缓冲液B按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各峰，采用PC12细胞检验法对各峰蛇毒神经生长因子活性进行测定，选取活性最高的峰冻干，于-20℃冰箱中保存；所述溶解用的PB缓冲液为0.02M，pH4.0；所述平衡用的PB缓冲液为0.02M，pH6.5；所述缓冲液B为0.5M的NaCl溶液，pH6.5。

9.根据根据权利要求5至7所述的眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法，其特征在于PC12细胞检验法按以下操作进行：用超纯水对所收集的各峰分别稀释10倍，100倍，1000倍，10000倍后加入含有PC12细胞的48孔板，于72h后观察细胞状态。