[发明专利]一种基于疏水基团修饰的蛋白质N-端富集方法

说明书

本发明涉及一种基于疏水基团修饰的蛋白质N‑端富集方法，包括：蛋白质水平封闭自由氨基、强疏水基团标记、反相材料亲和捕集。蛋白质样品首先在蛋白质水平上采用化学修饰封闭N末端以及侧链的自由氨基，然后对蛋白质进行酶解，并通过新产生的自由氨基于非N端肽段上引入强疏水基团，最后采用反相材料亲和去除带有强疏水基团的非N端肽段，从而得到蛋白质的N端肽段。本发明的优点是标记效率高、去除效率高、选择性高、处理步骤简单、且减少了样品的损失和非特异性吸附。

技术领域

本发明涉及蛋白质N-端富集方法，即一种基于疏水基团修饰的蛋白质N-端富集方法，以实现蛋白N-端的高效高选择性富集。

背景技术

蛋白质N末端的修饰是生物体内常见的翻译后修饰之一，常见的N端乙酰化与信号肽剪切与蛋白质的稳定性、定位及活性密切相关。此外，生物体内蛋白的降解与剪切加工是体内最常见的翻译后修饰之一，促使蛋白产生新的N末端，此类过程与细胞凋亡、趋化因子加工等众多生物学过程及生理机能密切相关。末端蛋白组学的建立也大大的促进了蛋白水解酶底物鉴定及位点分析等领域的发展。但是，生物样品中蛋白组分复杂，并且含量的动态分布范围宽，经过酶切后其复杂程度进一步增加，因此发展N末端肽段的富集方法，以提高N端肽段鉴定的覆盖度，对于了解生物过程及寻找疾病的生物标志物都起到重要作用。

蛋白质末端的富集主要分为两大类，正向富集与反向富集。正向富集通常在蛋白质末端引入亲和标签，酶解后通过亲和标签实现蛋白质N端富集(Cell 2008,134,866–876；Analytical Chemistry 2013,85,6826-6832；Proceedings of the National Academy ofSciences 2009,106,19310-19315)，此类方法可实现蛋白质N端肽段的高选择性富集，但是通常在N端引入标签的效率低，限制了方法的富集效率。此外正向富集方法无法获得内源性修饰的N端肽段，而生物样品中，大于50％的蛋白的N端存在內源性的修饰，因此反向富集方法获得了广泛的关注。反相富集通过氨基活性材料或带有标签的氨基活性试剂去除中间肽段从而得到末端肽段(Molecular&Cellular Proteomics 2012,11,832-842；NatureBiotechnology 2010,28,281-288；)。然而由于有限的键合效率和标记效率，非N端肽段难以去除完全，限制了方法的富集选择性；此外，所采用的去除材料存在难以消除的非特异性吸附，造成了末端肽段的丢失。

为克服以上方法所存在的问题，我们选择了效率高且简易快速的标记方法于非N端肽段引入亲和标签，并采用易获取且无显著非特异性吸附的材料对非N端肽段进行去除，以实现蛋白质N末端的高效高选择性无歧视富集。

发明内容

本发明发展了一种蛋白质N-端富集方法，标记效率高，富集效率高，选择性高，对不同性质N端肽段无歧视。

为了实现该目的，本发明的技术方案是：

1)采用氨基活性试剂封闭蛋白质上N端以及侧链的自由氨基

将蛋白质溶解于含2-8M盐酸胍pH为6-10的缓冲液中，加入终浓度10-100mM的二硫苏糖醇，45-90℃孵育30-120min后,加入终浓度20-500mM的丙烯酰胺，反应30-120min后，另加入终浓度10-100mM的二硫苏糖醇，孵育10-30min后，加入终浓度10-4000mM的氨基活性试剂，反应1-48h后，将溶液转移至3000-10 000Da的超滤膜上，离心去除溶剂并采用pH为6-10的缓冲液清洗残余试剂后，将蛋白溶于pH为6-10的缓冲液中，得到溶液A；

氨基活性试剂为甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐、乙酸-N-琥珀酰亚胺酯、丙酸-N-琥珀酰亚胺酯、丁酸-N-琥珀酰亚胺酯中的一种或者两种以上。；当采用甲醛、乙醛、丙醛、丁醛中的一种或者两种以上时，另加入终浓度10-600mM的氰基硼氢化纳；