[发明专利]一种基于疏水基团修饰的蛋白质N-端富集方法

权利要求书

1.一种基于疏水基团修饰的蛋白质N-端富集方法，包括：

1）采用氨基活性试剂封闭蛋白质上N端以及侧链的自由氨基；

2）采用蛋白水解酶酶解蛋白质，产生不带有自由氨基的N端肽段，以及于N端暴露新的自由氨基的非N端肽段；

3）采用带有碳链的氨基活性试剂作为强疏水基团标记非N端肽段；

4）采用反相材料吸附标记碳链的非N端肽段。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

1）所述的氨基活性试剂封闭蛋白质自由氨基，具体步骤如下：

将蛋白质溶解于含2-8 M盐酸胍pH为6-10的缓冲液中并进行变性、还原、烷基化，加入终浓度10-4000 mM的氨基活性试剂，反应1-48 h后，将溶液转移至3000-10 000 Da的超滤膜上，离心去除溶剂并采用pH为6-10的缓冲液清洗残余试剂后，将蛋白溶于pH为6-10的缓冲液中，得到溶液A；

2）所述的蛋白水解酶酶解蛋白质，具体步骤如下：

于所述的溶液A中加入蛋白水解酶进行酶解，蛋白水解酶酶用量为蛋白质质量的1/5-1/100，酶解时间为2-48 h，酶解温度25-45 °C，得到溶液B；

3）所述的带有碳链的氨基活性试剂标记非N端肽段，具体步骤如下：

于所述的溶液B中加入终浓度10-200 mM带有碳链的氨基活性试剂和10-600 mM氰基硼氢化钠，反应1-48 h，反应温度25-70 °C得到溶液C；

4）所述的反相材料吸附标记碳链的非N端肽段，具体步骤如下：

将所述的溶液C的溶剂进行挥发，采用上样溶液溶解后，上样到反相材料上，材料与蛋白质重量比为10-100 00，将材料采用上样溶液清洗后，采用洗脱溶液洗脱N端肽段；

按体积百分浓度计，上样溶液：2%乙腈+0.001%-2%三氟乙酸，其余为水；洗脱溶液：30%-80%乙腈+0.001%-2%三氟乙酸或甲酸，其余为水。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的带有碳链的氨基活性试剂，其所带碳链长度为10-20，且含有醛基基团。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：含有醛基基团为碳链长度为10-20的醛，为己醛、十五醛、十六醛、二十醛等中的一种或者两种以上。

5.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：酶为胰蛋白酶，蛋白内切酶Glu-C，蛋白内肽酶Arg-C, 金属蛋白内切酶Lys-N, 胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，弹性蛋白酶，或胃蛋白酶中的一种或二种以上。

6.按照权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述的氨基活性试剂为甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐、乙酸-N-琥珀酰亚胺酯、丙酸-N-琥珀酰亚胺酯、丁酸-N-琥珀酰亚胺酯中的一种或者两种以上；当采用氨基活性试剂为甲醛、乙醛、丙醛、丁醛中的一种或者两种以上时，另加入终浓度10-600 mM的氰基硼氢化纳。

7.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的缓冲液为磷酸氢二钠缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三乙二胺碳酸盐缓冲液、碳酸氢纳缓冲液中的一种或者两种以上；

缓冲液浓度为10-500 mM。

8.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：反相材料为C18反相材料，C8反相材料，苯基反相材料中的一种或二种以上。

9.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：

变性以及还原的具体过程和条件为：加入终浓度10-100 mM的二硫苏糖醇，45-90 °C孵育30-120 min；

烷基化的具体过程和条件为：加入终浓度20-500 mM的丙烯酰胺，反应30-120 min后，另加入终浓度10-100 mM的二硫苏糖醇，孵育10-30 min。

10.按照权利要求1所述的方法，其可应用于生物样品中蛋白N-端的测序，蛋白异构体的鉴定，蛋白剪切加工的鉴定，以及水解酶水解底物及位点的鉴定中的任意一种或二种以上的操作过程中；

生物样品为细胞、组织、体液中的一种或二种以上。