[发明专利]一种猪博卡病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定 量检测猪博卡病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。

背景技术

猪博卡病毒（Porcinebocavirus，PBoV）为无囊膜单股线状DNA病毒，属于细小病 毒科细小病毒亚科博卡病毒属，其基因组大小为5.2kb左右。动物博卡病毒在20世纪60年 代早期就已被发现，早期的动物博卡病毒包括牛细小病毒(Bovineparvovirus，BPV)和 犬微小病毒(Canineminutevirus，CnMV)2种。2005年，人博卡病毒在一名表现为下呼 吸道疾病的瑞典儿童体内经PCR技术被首次鉴定。2009年瑞典A.L.Blomstrom等利用随机 多重置换扩增方法和高通量基因测序技术，从表现为PMWS的发病猪群中首次检出并鉴定 到猪博卡病毒。继首例报道后，美国、爱尔兰、乌干达等欧洲国家也相继发现PBoV，在中国的 河北、江苏、山东福建、广西、河南、新疆及香港等大部分地区均有检出。近年的资料表明，我 国的PBoV1的感染率为39.3%～63.2%，PBoV2的感染率为0.76%～6.6%，PBoV3的感染率 为12.59%～64.4%，PBoV3和PBoV4在香港的感染率为16.5%。以上数据表明各型别的猪博 卡病毒在我国猪群中已广泛存在。

自2009年第一次发现猪博卡病毒以来，大量研究表明，从患断奶猪多系统衰竭综 合症PMWS的病猪组织、粪便等样本内均分离和检测到PBoVs，且病毒的检出率高于正常猪， 这提示PBoVs可能与PMWS的发生有一定关联。另外，该病与猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV)、猪圆环病毒(PCV-2)及猪瘟病毒(CSFV)的协同感染也会加剧这些疫病的发 生。因此，对猪博卡病毒病密切监测和快速诊断，有利于上述猪病的防治。

目前，PBoV的检测技术主要有血清学方法和分子生物学方法。常规方法是间接免 疫荧光检测，其结果准确可靠，但存在操作复杂、需要抗原分离鉴定和抗体制备、所需时间 长的缺点，不利于猪博卡病毒病的快速诊断。分子生物学的方法是通过聚合酶链式反应 （PCR）方法检测猪博卡病毒病病毒的特异性基因，虽然PCR方法较常规方法快速准确，但需 要设计特异性强的引物和昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶 电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪博卡病毒的方法，公开 一种快速、实时定量的检测猪博卡病毒环介导等温扩增试剂盒。为实现本发明目的所使用 的技术方案为：一种猪博卡病毒环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括LAMP引物、2×反应 缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪博卡病毒DNA模板，所述的LAMP引 物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQ IDNO：4）和环引物LF（SEQIDNO：5）与LB（SEQIDNO：6）；；

其中引物的序列分别为：

F3CCTGACAGAAAGAAGCTGAA

B3ACTCCAACTCCGATGTCG

FIPTCTGATTCATCCTGTGGCTGTGAGGTACTTACTAAAGAACAGGAAG

BIPGATCGAGCTATACAACCGAAGAAGGCTCTGTTTCGGAGATGT

LFATGCCCACTCATCTAGGAACT

LBAGAGCAGCTCTTCGAATCGC；

所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和 dNTPs。

所述的猪博卡病毒DNA模板，是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒从疑似猪博卡 病毒病变组织、粪便样品或培养物中提取的猪博卡病毒基因组DNA。

所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。