[发明专利]利用截短柔性残基提高普鲁兰酶催化性能的方法

说明书

本发明公开了利用截短柔性残基提高普鲁兰酶催化性能的方法，属于酶工程技术领域。本发明通过去除Bacillus naganoensis JNB‑1普鲁兰酶的氨基酸序列的N端的前5、22、45、64、78、106位氨基酸以及C端的后9、36位氨基酸，获得的所有突变酶的K_m值都降低了，说明截短提高了酶与底物的亲和力；此外PulΔN5和PulΔN106的酶活分别比野生酶提高了42％、17％，PulΔN5、PulΔN106、PulΔC9的比活力分别比野生酶提高了21％、15％，PulΔN5、PulΔN78、PulΔC9的半衰期分别比野生型提高了10h、12h、24h，PulΔN5、N45、PulΔN78、PulΔN106和PulΔC9的k_cat/K_m值提高，说明突变酶拥有更高的催化效率。本发明的普鲁兰酶更适合工业应用。

技术领域

本发明涉及利用截短柔性残基提高普鲁兰酶催化性能的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

普鲁兰酶是解支酶的一种，能水解的最小底物只需两条由α-1,6糖苷键连接的含有两个由α-1,4糖苷键连接的葡萄糖链段。由于淀粉结构的复杂性，在淀粉解聚为低聚糖或小分子单糖的过程中必须由多种酶协同作用。在淀粉糖化过程中，由于糖化酶对α-1,6糖苷键的作用有限，因此目前双酶法生产淀粉糖制品的最高转化率只能达到96％。如果在糖化过程中添加普鲁兰酶与糖化酶协同作用，则可将转化率提高到97％以上，并提高生产效率，降低生产成本。

I型普鲁兰酶是糖苷水解酶13家族的成员之一，该家族成员的主要的催化部位由四个结构域A、B、C、F构成。结构域A是由8个β-折叠、8个α-螺旋构成的中央催化的(β/α)₈折叠桶结构，该区域包含了催化三联体(Asp,Asp,Glu)。较小的结构域B插入(β/α)₈折叠桶的第三个β-折叠和第三个α-螺旋的中间，活性口袋正位于该结构域，且(vβ/α)₈折叠桶桶壁也由该结构域构成。由8个β-折叠形成希腊钥匙拓扑结构是结构域C的特征性结构。而F结构域由一个小的a螺旋和6个β-折叠，折叠形成的β三明治基序的β-反平行片层。结构域A的C端和N端分别连接着结构域C和结构域F。

1943年首次报道普鲁兰酶，1991年Tomimura从长野芽胞杆菌(B.naganoensis，ATCC No.53909)中分离出了普鲁兰酶。到目前为止，已经从芽孢杆菌、产气气杆菌、放线菌，链球菌、链霉及一些嗜热菌中发现普鲁兰酶，不同来源的普鲁兰酶，酶学性质也各有不同。由于糖化酶的作用条件具有高温(55℃–65℃)和弱酸性(pH 4.5–5.5)的特点，所以大多数天然的普鲁兰酶的酶学性质限制了其在工业生产中的应用。

因此，改善普鲁兰酶的酶学性质以扩宽其在工业生产中的应用，是目前亟需解决的问题。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供了一种利用截短柔性残基提高普鲁兰酶催化性能的方法，并提供了一种普鲁兰酶突变体，所述突变体的氨基酸序列相对于Bacillusnaganoensis来源的普鲁兰酶的氨基酸序列，发生了N端或C端柔性区域的截短。

在本发明的一种实施方式中，所述截短是指截去N端的前5个、22个、45个、64个、78个或106个氨基酸(分别命名为PulΔN5、PulΔN22、PulΔN45、PulΔN64、PulΔN78、PulΔN106)，或者是截去C端的最后9个或最后36个氨基酸(分别命名为PulΔC9、PulΔC36)。

在本发明的一种实施方式中，所述Bacillus naganoensis来源的普鲁兰酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示(按N端-C端的顺序)。

在本发明的一种实施方式中，所述Bacillus naganoensis来源的普鲁兰酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。