[发明专利]一种诱导长茄游离小孢子愈伤组织的形成及植株再生方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程领域的植物培养方法，具体涉及一种诱导长茄游离小孢子愈伤组织的形成及植株再生方法。

背景技术

茄子属于茄科茄属，常异花作物，是世界各地广泛栽培的重要蔬菜之一。传统的育种需要先纯化亲本，而一个茄子育种材料的纯合需要自交5-6代，一个新品种的培育需7-8年时间，此育种方法既浪费时间，又浪费工力。目前，茄子遗传育种的研究热点是利用植物细胞的全能性快速获得纯合体，稳定植株性状，创制出新的育种材料，充分利用杂种优势。小孢子培养是快速获得纯合体最有效的方法之一。小孢子培养是在单细胞水平上利用小孢子培养诱导的单倍体经染色体加倍后获得高度纯合的纯合双单倍体的培养方法。近年来，一些研究者关于茄子游离小孢子和花粉培养做了大量工作，致力于优化(脱分化和再分化）小孢子成胚和胚状体成苗体系，但目前尚有许多基因型小孢子脱分化较难，二倍体栽培种小孢子愈伤组织再分化成苗率较低，限制了这一技术在实际育种工作中的应用范围。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诱导长茄游离小孢子愈伤组织的形成及植株再生方法，旨在提高长茄小孢子的愈伤组织的诱导能力、成活率、芽分化率以及植株生根率。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供的高效诱导长茄游离小孢子愈伤组织的形成及植株再生方法，主要步骤如下：取合适的花蕾用吐温和次氯酸钠混合液振荡消毒15min，无菌水冲洗后用挤压的方法分离出小孢子，过滤离心收集小孢子，稀释到1.0×10⁵ 个/ml，35-36℃下进行热激处理3-5d，然后添加液体培养基2进行黑暗静止培养，培养4-7d时添加液体培养基3，15-20d后陆续出现肉眼可见的愈伤组织，当愈伤组织块径长到2cm左右时转移到分化培养基上，同时加入1-2ml液体培养基3与分化培养基形成固液共培养，培养60d后可分化出芽点，当芽点长到2-3cm时可将其从愈伤组织块上分离，转入过渡培养基上继续培养，过渡培养10-15d后转入1/2MS培养基中进行生根培养，15-20d可以分化出发达根系，形成完整植株。

具体方法包括如下：

（1）花蕾的选取与消毒:选取花萼微张、未裂开、花药绿白色或黄绿色的花蕾，取20-25朵花蕾在加入200μl吐温和50ml 8wt.%次氯酸钠的混合溶液中振荡消毒15min，在无菌条件下用无菌水冲洗3-4次，用无菌滤纸吸干水分备用；

（2）小孢子分离与收集: 将已消毒的花蕾剥取花药于研钵中，取20-25朵花蕾的花药集中在一个研钵中，加入2ml 91g/L甘露醇的洗液用研杵挤压花药，然后再加入8ml洗液，用200目无纺布过滤于带盖离心管，1000r/min离心3分钟，弃上清液，收集沉淀，加入10ml 91g/L甘露醇的洗液重悬，1000r/min离心3分钟，重复洗涤沉淀2次；

（3）小孢子的愈伤组织诱导及培养过程：用热激培养基1将分离的小孢子稀释到1.0×10⁵ 个/ml，吸取3-4ml于直径6cm培养皿中，封口，35-36℃黑暗静止培养；培养3-5天后培养皿加入等体积液体培养基2，然后均分成2皿，封口，在25℃下继续黑暗静止培养；培养4-7天后每皿再添加等体积液体培养基3，然后每皿均分成2皿，封口，继续在25℃黑暗静止培养，7-10天后形成肉眼可见的愈伤组织；

（4） 愈伤组织分化培养：当愈伤组织长到2mm，转移到分化培养基上，每瓶4-5个愈伤组织，采用固液共培，即每瓶加入1-2ml液体培养基3，然后在3000-5000Lx光照，12-14h·d^-1条件下培养，20天继代一次，培养60天分化出芽；

（5）过渡培养：当芽长到2-3cm时即从愈伤组织上分离，转入过渡培养基上培养10-15天；

（6）生根培养：转入1/2 MS培养基中进行生根培养，15-20天分化出发达根系，形成完整植株。

所述的热激培养基1包含以下成分：1.5 NLN培养基中添加甘露醇80-100 g·L^–1 、水解酪蛋白130-170mg·L^–1、2, 4-D 0.1-1mg·L^–1 、NAA 0.1-1 mg·L^–1、6-BA 0.1-1 mg·L^–1。