[发明专利]一种诱导长茄游离小孢子愈伤组织的形成及植株再生方法

权利要求书

1.一种诱导长茄游离小孢子愈伤组织的形成及植株再生方法，其特征在于：取花蕾进行消毒处理，然后分离出消毒过的花蕾中的小孢子，在35-36℃下进行热激处理，然后在液体培养基中进行黑暗静止培养，15-20d后陆续出现肉眼可见的愈伤组织，当愈伤组织块径长到2mm时转到分化培养基上，同时加入1-2ml液体培养基形成固液共培养，60d后分化出芽点，当芽点长到2-3cm即从愈伤组织上分离，转入过渡培养基上继续培养，10-15d后转入1/2MS培养基进行生根培养，15-20d分化出发达根系，形成完整植株；

具体方法包括如下：

（1）花蕾的选取与消毒:选取花萼微张、未裂开、花药绿白色或黄绿色的花蕾，20-25朵花蕾在加入200μl吐温和50ml 8wt.%次氯酸钠的混合溶液中振荡消毒15min，在无菌条件下用无菌水冲洗3-4次，用无菌滤纸吸干水分备用；

（2）小孢子分离与收集: 将已消毒的花蕾剥取花药于研钵中，取20-25朵花蕾的花药集中在一个研钵中，加入2ml 91g/L甘露醇的洗液，用研杵挤压花药，然后再加入8ml洗液，用200目无纺布过滤于带盖离心管，1000r/min离心3分钟，弃上清液，收集沉淀，再加入10ml 91g/L甘露醇的洗液重悬，1000r/min离心3分钟，再加入洗液洗涤沉淀2次；

（3）小孢子的愈伤组织诱导及培养过程：用热激培养基1将分离的小孢子稀释到1.0×10⁵ 个/ml，吸取3-4ml于直径6cm培养皿中，封口，35-36℃黑暗静止培养；培养3-5天后培养皿加入等体积液体培养基2，然后均分成2皿，封口，在25℃下继续黑暗静止培养；培养4-7天后每皿再添加等体积液体培养基3，然后每皿均分成2皿，封口，继续在25℃黑暗静止培养，7-10天后形成肉眼可见的愈伤组织；

（4） 愈伤组织分化培养：当愈伤组织长到2mm，转移到分化培养基上，每瓶4-5个愈伤组织，采用固液共培，即每瓶加入1-2ml液体培养基3，然后在3000-5000Lx光照，12-14h·d^-1条件下培养，20天继代一次，培养60天分化出芽；

（5）过渡培养：当芽长到2-3cm时即从愈伤组织上分离，转入过渡培养基上培养10-15天；

（6）生根培养：转入1/2 MS培养基中进行生根培养，15-20天分化出发达根系，形成完整植株；

所述的热激培养基1包含以下成分：1.5 NLN培养基中添加甘露醇80-100 g·L^–1 、水解酪蛋白130-170mg·L^–1、2, 4-D 0.1-1mg·L^–1 、NAA 0.1-1 mg·L^–1、6-BA 0.1-1 mg·L^–1；

所述液体培养基2包含以下成分：1.5 NLN培养基、蔗糖50-70g· L^–1 、水解酪蛋白130-170mg· L^–1、2,4-D 0.1-1mg·L^–1 、NAA 0.1-1 mg·L^–1、6-BA 0.1-1 mg·L^–1；液体培养基3包含以下成分：1.5 NLN培养基、蔗糖20-40g· L^–1 、水解酪蛋白130-170mg·L^–1、2,4-D 0.1-1mg·L^–1 、NAA 0.1-0.5 mg·L^–1、6-BA 0.1-0.5 mg·L^–1；

所述分化培养基包含以下成分：MS培养基、蔗糖20-40 g·L^–1 、琼脂5-8 g·L^–1 、NAA 0.001-0.01mg·L^–1、ZT 0.5-1.5mg·L^–1；

所述过渡培养基包含以下成分：MS培养基、蔗糖20-40 g·L^–1 、琼脂5-9 g·L^–1 、活性炭0.5-1.5wt.%、NAA 3-7 mg·L^–1、IAA 0.1-1mg·L^–1。