[发明专利]一种异种脱细胞真皮基质的制备方法

说明书

本发明公开了一种异种脱细胞真皮基质的制备方法，具体包括以下几个步骤：取皮、脱表皮层、脱细胞处理、激光打孔、灭菌。本发明提供的异种脱细胞真皮基质的制备方法，对于细胞成分去除干净，抗原性低，保留了真皮胶原结构，组织相容性良好，且整个制备过程时间仅60h左右，处理时间短，处理成本低，具有良好的社会效益和经济效益。

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，具体涉及一种异种脱细胞真皮基质的制备方法。

背景技术

烧伤、创伤、上皮癌切除及皮肤疾病等因素造成的皮肤缺损常遗留瘢痕增生和挛缩畸形，严重影响外观和功能。目前，用于修复创面的修复材料除了自体皮、皮瓣外，主要有异体皮、异种皮以及各种人工合成的创面覆盖物。在治疗大面积烧伤患者时，患者自体皮源有限，就需要应用这些皮肤替代物；异体皮来源有限，并有传染疾病的风险，且受到伦理学的制约；人工合成材料技术尚不成熟，抗感染能力较差，且价格昂贵。与之相比，异种皮经过脱细胞变性处理后，抗原性降低，来源广泛、价格低廉，且保存了真皮组织中绝大部分的有效组织成分和框架结构，最大限度地模拟了人体皮肤的组织结构，可更好地诱导宿主细胞的生长和皮肤胶原的重建。

目前，异种脱细胞真皮基质的制备方法主要有：(1)反复冻融法：通过对新鲜皮肤进行3次以上的反复冻融；(2)胰酶消化法：通过外源性蛋白酶对真皮中的细胞进行消化；(3)磷酸盐缓冲液浸泡法：通过对真皮内的内源性酶的激活，将皮肤中的细胞成分进行有效的清除；(4)DispaseII-Triton法：将真皮首先采用DispaseII进行处理，然后再使用TritonX-100进行处理；(5)高渗盐-SDS法：将真皮首先采用高渗盐进行处理，然后再采用破膜剂十二烷幕硫酸钠(SDS)将真皮中的细胞成分彻底的脱除；(6)高渗盐-NaOH消蚀法：首先利用高渗盐将表皮去除，然后再通过NaOH的吸水作用，使细胞发生脱水死亡而将真皮中的细胞成分彻底的去除。虽然现有的异种脱细胞真皮基质的制备已经比较成熟，但是在其制备和应用中还存在一些问题，如：细胞成分去除不彻底，抗原性高，组织相容性差，易导致植皮的失败；对基底膜结构破坏性较大，不利于上皮细胞的粘贴与生长；制备过程复杂，处理时间过长；制备成本高等。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种处理周期短、对真皮细胞外基质结构破坏性小的异种脱细胞真皮基质的制备方法。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种异种脱细胞真皮基质的制备方法，具体包括以下步骤：

1)取皮：选用巴马香猪皮为皮源，对取皮区进行脱毛、消毒，用取皮刀切取带有表皮层和真皮层的断层皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯铵溶液浸泡20～40min，去脂杀菌；

2)脱表皮层：将步骤1)得到的断层皮片用0.25％胰蛋白酶溶液于4℃恒温条件下浸泡，剥离表皮层，剩余部分为真皮基质，用无菌PBS溶液洗涤3～5次；

3)脱细胞处理：将步骤2)得到的真皮基质放入0.5％的Triton X-100溶液中，室温下超声3～7min后再摇床震荡5～6h，再次超声3～7min后摇床震荡3～4h，取出真皮基质，放入无菌PBS溶液中摇床震荡1～2h，重复Triton X-100溶液超声震荡-超声震荡-无菌PBS溶液震荡以上步骤1次，取出真皮基质，再用4％脱氧胆酸钠溶液超声清洗3～7min，摇床振荡2～3h，再用无菌PBS溶液中摇床震荡2～3h，破碎真皮中的细胞成分，并洗脱，得到脱细胞真皮基质；

4)激光打孔：用激光在步骤3)得到的脱细胞真皮基质上间断打孔，用无菌PBS溶液洗涤3～5次；

5)灭菌：将步骤4)的洗涤后的脱细胞真皮基质封装，经Co-60γ射线辐照消毒灭菌，即得成品。