[发明专利]检测KRAS基因4号外显子密码子突变的引物对、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地说，本发明涉及一种检测KRAS基因4号外显子117号和146号密码子突变的引物对、试剂盒及方法。

背景技术

KRAS基因是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是ras基因家族成员之一，编码KRAS蛋白。它是EGFR信号转导通路一个重要的下游调控基因，KRAS基因发生突变时无需EGFR接受信号，能够自动活化该通路并启动下游的信号转导，导致细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控。

随着现代医学的快速发展，分子靶向药物的个体化治疗得到广泛应用。2008年，美国国家癌症综合治疗联盟(NCCN)在《结直肠癌临床实践指南》中首次提出EGFR靶向药物疗效与KRAS基因状态密切相关。2011年，NCCN在《结直肠癌临床实践指南》(V3.2011)明确指出：(1)所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态；(2)只有KRAS基因野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如西妥昔单抗和帕尼单抗)的治疗。2015年，NCCN对《结直肠癌临床实践指南》(V2.2015)做了更新：检测KRAS基因状态，包括KRAS外显子2和外显子3，4以及NRAS基因的外显子2，3和4，此外，还需检测BRAF基因状态，无论是否有KRAS突变。

KRAS基因的4号外显子117号和146号作为热点突变位点，越来越多临床实验室开始开展该项目检测。目前较常用的方法包括：测序法、基于探针的荧光定量PCR法等。测序法因为可以读出DNA每个碱基的变化，目前被认为是 检测基因突变的金标准方法，但因为灵敏度低，测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员的要求较高，不易于形成标准化操作的分子诊断产品。基于探针的荧光定量PCR法检测基因突变是通过已知的特异性探针实现的，该方法灵敏度高、特异性好，目前已有基于该方法的检测KRAS基因突变的商品化试剂盒，但该方法针对于KRAS基因4号外显子117号和146号密码子上发生的稀有突变类型，则检测不出来，且检测试剂成本高。

因此，有必要提供一种改进的方法以实现KRAS基因的4号外显子117号和146号密码子突变状态的快速、准确且廉价的检测方法。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种针对检测KRAS基因的4号外显子117号和146号密码子突变的引物对、试剂盒及HRM检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种检测KRAS基因4号外显子密码子突变的引物对，所述引物对为：针对117号密码子突变检测的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，和/或针对146号密码子突变检测的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

本发明还提供了一种检测KRAS基因4号外显子密码子突变的试剂盒，所述试剂盒包括针对117号密码子突变检测的如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对、和/或针对146号密码子突变检测如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物对。

在其中一些实施例中，所述检测试剂盒还包括饱和荧光染料。

在其中一些实施例中，所述饱和荧光染料为Eva Green。

在其中一些实施例中，所述检测试剂盒还包括Buffer、dNTP和Taq酶。

本发明还提供了一种检测KRAS基因4号外显子密码子突变的反应体系，所述反应体系包括针对117号密码子突变检测的如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物对、和/或针对146号密码子突变检测的如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物对。

在其中一些实施例中，所述反应体系还包括Eva Green、dNTP和Taq酶。