[发明专利]快速提取线粒体DNA的方法及其应用与相关试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及快速提取DNA的方法及其应用，特别涉及快速提取线粒体DNA的方法及 其应用与相关试剂盒。

背景技术

线粒体DNA是人体细胞内唯一的核外遗传物质，线粒体的染色体长约16000个核苷 酸，染色体是环状的，而且突变率高于核中DNA，有些遗传病如Leber遗传性视神经病、肌阵 挛性癫痫、糖尿病-耳聋综合征等与线粒体基因突变有关。

Leber遗传性视神经病为视神经退行性变的母系遗传性疾病。男性患者居多，常于 15～35岁发病，临床主要表现为双眼同时或先后急性或亚急性无痛性视力减退，同时可伴 有中心视野缺失及色觉障碍。视力损害严重程度差异较大，可由完全正常、轻度、中度到重 度。线粒体中9种编码蛋白的基因(ND1，ND2，CO1，ATP6，CO3，ND4，ND5，ND6，CYTB)中，至少有 18种错义突变可直接或间接地导致Leber表型的出现。90％以上的病例中存在三种突变 (MTND1*LHON3460A，MTND4*LHON11778A，MTND6*LHON14484C)。

现有对Leber疾病在基因水平的检测方法较多，大致都包含血液基因组DNA抽提、 DNA目的片段的体外分别扩增(以上三个位点需要进行3次独立PCR扩增实验)、扩增产物测 序检查三个步骤。

外周血因其属无创伤获取且获取简单，是最容易被患者接受的检查样品，因此也 是临床检测用到最多的样品之一。但现有检测技术和方法，在检查外周血线粒体DNA基因序 列时，需要先将血液细胞中基因全部抽提出来，才能作为模板进行下游的PCR扩增。虽然这 样做并不直接影响最后检测的结果，但由于血液DNA抽提步骤多，过程繁琐，外加临床样品 的数量极大，现有的方法不但费时费力，而且很容易在操作过程增加样品的二次污染。

发明内容

为解决现有技术中提取线粒体DNA抽提步骤多、过程繁琐的技术问题，本发明的目 的之一在于提供一种提取线粒体DNA的方法，所述方法能够简便快速的提取血液或组织中 线粒体DNA。

本发明再一目的在于提供提取线粒体DNA的试剂盒。

本发明另一目的在于提供提取线粒体DNA并进行PCR扩增的方法。

本发明再一目的在于提供提取线粒体DNA并进行PCR扩增的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供用于检测Leber遗传性视神经病的试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供提取线粒体DNA的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将组织样品或去除红细胞后的血液样品进行分散；

(2)在分散后的细胞样品中加入裂解缓冲液，所述裂解缓冲液为包含Tris-HCl及 TritonX-100的水溶液，该Tris-HCl的摩尔浓度为19～21mM，其pH为8.7～8.9；该TritonX- 100的体积浓度为0.09～0.11％；或

所述裂解缓冲液为包含Tris-HCl及SDS的水溶液，该Tris-HCl的摩尔浓度为19～ 21mM，其pH为8.7～8.9；该SDS的质量浓度为0.09％～0.11％；

(3)分离步骤(2)上清液，提取得到所述样品的线粒体DNA。

本发明针对现有技术的不足，依据线粒体DNA独立于基因组DNA之外且以环状形式 存在于细胞中的特征，利用由上述组分构成的裂解液对细胞及细胞内的蛋白进行简单裂 解、变性处理，将线粒体DNA释放出来，完成了整个线粒体DNA的提取，减去了整个基因组DNA 抽提过程，从而短时间内获得了可作为扩增模板的线粒体DNA。由本发明方法提取的线粒体 DNA与现有的技术抽提出DNA浓度扩增效果一致。采用本发明的方法不但大大减轻了操作人 员的工作强度，而且可以最大限度的避免因操作所导致的样品的相互污染。

根据本发明的具体实施方式，在本发明所述提取线粒体DNA的方法中，步骤(2)中 所述裂解缓冲液为包含Tris-HCl及TritonX-100的水溶液，该Tris-HCl的摩尔浓度为20mM， 其pH为8.8；该TritonX-100的体积浓度为0.1％；或

所述裂解缓冲液为包含Tris-HCl及SDS的水溶液，该Tris-HCl的摩尔浓度为20mM， 其pH为8.8；该SDS的质量浓度为0.1％。