[发明专利]快速提取线粒体DNA的方法及其应用与相关试剂盒

权利要求书

1.提取线粒体DNA的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将组织样品或去除红细胞后的血液样品进行分散；

(2)在分散后的细胞样品中加入裂解缓冲液，所述裂解缓冲液为包含Tris-HCl及 TritonX-100的水溶液，该Tris-HCl的摩尔浓度为19～21mM，其pH为8.7～8.9；该TritonX- 100的体积浓度为0.09～0.11％；或

所述裂解缓冲液为包含Tris-HCl及SDS的水溶液，该Tris-HCl的摩尔浓度为19～21mM， 其pH为8.7～8.9；该SDS的质量浓度为0.09％～0.11％；

(3)分离步骤(2)上清液，提取得到所述样品的线粒体DNA。

2.根据权利要求1所述的提取线粒体DNA的方法，其中，步骤(2)中所述裂解缓冲液为包 含Tris-HCl及TritonX-100的水溶液，该Tris-HCl的摩尔浓度为20mM，其pH为8.8；该 TritonX-100的体积浓度为0.1％；或

所述裂解缓冲液为包含Tris-HCl及SDS的水溶液，该Tris-HCl的摩尔浓度为20mM，其pH 为8.8；该SDS的质量浓度为0.1％。

3.根据权利要求1或2所述的提取线粒体DNA的方法，其中，步骤(2)中分散后的细胞样 品的体积与所述裂解缓冲液的体积比为8～10:1，优选9:1。

4.根据权利要求3所述的提取线粒体DNA的方法，其中，所述加热是在95～100℃加热9 ～11min；优选在100℃加热10min。

5.提取线粒体DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括裂解缓冲液(10×)，所述裂解缓冲 液(10×)为包含Tris-HCl及TritonX-100的水溶液，该Tris-HCl的摩尔浓度为190～210mM， 其pH为8.7～8.9；该TritonX-100的体积浓度为0.9～1.1％；或

所述裂解缓冲液(10×)为包含Tris-HCl及SDS的水溶液，该Tris-HCl的摩尔浓度为190 ～210mM，其pH为8.7～8.9；该SDS的质量浓度为0.9％～1.1％；

优选地，该试剂盒还包括红细胞裂解液。

6.提取线粒体DNA并进行PCR扩增的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)利用权利要求1～4中任一项所述的提取线粒体DNA的方法提取得到线粒体DNA；

(b)以步骤(a)得到的线粒体DNA为模板，利用引物对1、引物对2及引物对3进行PCR扩 增；选择性地，将所述线粒体DNA稀释5～10倍；

其中，所述引物对1包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示序列：

SEQIDNO:1：GCCTACGACAAACAGACCTAAA；

SEQIDNO:2：GGTTGAGGGATA；

所述引物对2包括SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示序列：

SEQIDNO:3：CAATAGGATCCTCCCGAATCAA；

SEQIDNO:4：GTGTGGTCGGGTGTGTTATTA；

所述引物对3包括SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示序列：

SEQIDNO:5：CCTACTCCTCATTGTACCCATTC；

SEQIDNO:6：TGATGTAGAGGGTGATGGTAGA。

7.根据权利要求6所述的提取线粒体DNA并进行PCR扩增的方法，其中，所述PCR扩增采 用20μlPCR体系，所述PCR体系包括：

1.9～2.1μl所述裂解缓冲液、0.3～0.5μldNTP混合物、0.1～0.3μlDNA聚合酶、0.4～ 0.6μl所述引物对1、0.4～0.6μl所述引物对2、0.4～0.6μl所述引物对3、0.9～1.1μl所述模 板及余量的DEPC水；

优选地，所述PCR体系为2.0μl所述裂解缓冲液、0.4μldNTP混合物、0.2μlDNA聚合酶、 0.5μl所述引物对1、0.5μl所述引物对2、0.5μl所述引物对3、1μl所述模板及余量的DEPC水。