[发明专利]多核苷酸片段、包含其的表达载体和黑曲霉基因工程菌种及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体而言，涉及多核苷酸片段、包含其的表达载体和黑曲霉基因工程菌种及其应用。

背景技术

α-葡萄糖转苷酶(α-glucosidase,EC 3.2.1.20)又叫α-D-葡萄糖苷水解酶，以前称作麦芽糖酶(maltase)。该酶从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1,4糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基以α-1,6糖苷键转移到另一糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖(简称IMOs，主要包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等)。

低聚异麦芽糖(Isomaltooligosaccharide)是公认的有效的双歧杆菌生长促进因子。双歧杆菌具有清除人体垃圾、分解致癌物质、降低血液中胆固醇水平、预防高血压、合成维生素和氨基酸、防止便秘、抑制许多病原菌生长和增强人体免疫等功能，是保健食品的基料。它甜味柔和、粘度低、保湿性好、水分活度低、易保存、在酸性条件下对热稳定性好、对龋齿有明显抑制作用，是儿童糖果、食品、饮料的理想原料，在国外已经广泛地应用于保健品工业和其他食品工业中。其产量日益增长。

α-葡萄糖转苷酶是生产低聚异麦芽糖的关键酶。虽然黑曲霉(Aspergillus niger)可产α-葡萄糖转苷酶，但野生黑曲霉的产酶水平低，难以提取纯化。

发明内容

本发明提供了多核苷酸片段、包含其的表达载体和黑曲霉基因工程菌种及其应用。

具体而言，本发明提供了：

(1)一种多核苷酸片段，包含黑曲霉(Aspergillus niger)丙酮酸激酶启动子、和与该黑曲霉丙酮酸激酶启动子有效连接的黑曲霉α-葡萄糖转苷酶基因。

(2)根据(1)所述的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段还包含与所述黑曲霉α-葡萄糖转苷酶基因有效连接的终止子。

(3)根据(1)所述的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段还包含与所述黑曲霉α-葡萄糖转苷酶基因有效连接的抗性筛选基因。

(4)根据(1)所述的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段在5’至3’方向上依次包含彼此有效连接的黑曲霉丙酮酸激酶启动子、黑曲霉α-葡萄糖转苷酶基因、终止子和抗性筛选基因。

(5)根据(2)或(4)所述的多核苷酸片段，其中所述终止子为trpC基因终止子。

(6)根据(3)或(4)所述的多核苷酸片段，其中所述抗性筛选基因为潮霉素B基因。

(7)根据(6)所述的多核苷酸片段，其中所述潮霉素B基因中的NdeI酶切位点被去除。

(8)根据(1)所述的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸片段具有序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

(9)一种表达载体，其含有(1)-(8)中任一项所述的多核苷酸片段。

(10)根据(9)所述的表达载体，其中所述表达载体含有包含酶切位点HindIII、NdeI、BglII、SnaBI和PstI的多克隆位点片段，并且所述多核苷酸片段位于所述多克隆位点片段中。

(11)根据(10)所述的表达载体，其中所述表达载体在5’至3’方向上依次包含所述HindIII、所述黑曲霉丙酮酸激酶启动子、所述NdeI、所述黑曲霉α-葡萄糖转苷酶基因、所述BglII、所述终止子、所述SnaBI、所述抗性筛选基因和所述PstI。

(12)根据(10)所述的表达载体，其中所述多克隆位点片段具有序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

(13)根据(9)所述的表达载体，其中所述表达载体为直链状。

(14)一种黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌种，其特征在于，其基因组DNA中插入有(1)-(8)中任一项所述的多核苷酸片段。

(15)根据(14)所述的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌种用于生产α-葡萄糖转苷酶的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1.本发明构建了可用于高效表达α-葡萄糖转苷酶的多核苷酸片段，在利用该多核苷酸片段对黑曲霉(Aspergillus niger)进行基因工程改造之后，提高了该菌种的产酶量。

2.本发明提供了一种高产酶量高效生产α-葡萄糖转苷酶的黑曲霉(Aspergillus niger)基因工程菌种。该黑曲霉基因工程菌种适合用于工业生产。

附图说明

图1示出本发明一个实施方案中所构建的质粒L-PUC18的示意图。