[发明专利]用于制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的DNA分子和方法

说明书

本发明公开了用于制备反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的DNA分子和方法。本发明公开的DNA分子，为将L‑脯氨酸‑4‑羟化酶编码基因(P4H基因)的密码子进行优化后的序列P4Hm进行二次优化而得到的DNA分子(P4HGP基因)，其序列为序列表中序列1；用于制备反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的方法，包括：将含有P4HGP基因并表达P4H的重组微生物置入含有L‑脯氨酸的初始物质的体系中进行反应，得到反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸。实验证明，与P4Hm基因相比，利用P4HGP基因得到的反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸产量提高了19.7％，表明可以利用P4HGP基因生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中用于制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的DNA分子和方法。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-proline，Hyp)是广泛存在于动物胶和骨胶原中的亚氨基酸，分子式如式1。

反式-4-羟基-L-脯氨酸可以作为胶原蛋白合成的增强剂而用于化妆品和医药产品。也可以作为许多组织(如皮肤、骨骼和消化道)的补充营养物而用于食品行业。此外，反式-4-羟基-L-脯氨酸带有手性分子，是合成药物时有用的手性元件。其有用的衍生品包括MK-1220(被认为是一个高活性的丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂)；聚胺-4-L-THOP(被用作非降解性丙烯酸骨结合剂)；N-乙酰THOP(奥沙西罗)，可以抑制炎症和减少肿胀，是有用的治疗骨关节炎等影响结缔组织疾病，奥沙西罗已经被确立为一种无毒副作用的治疗关节疾病的药物。

目前，国内生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的主要方法是生物提取法，利用动物蛋白来源如明胶、猪皮为原料，经酸、碱水解后提取反式-4-羟基-L-脯氨酸，该方法纯化步骤长，成本高，且废弃物污染严重。随着脯氨酸-4-羟化酶的开发和生物技术的发展，利用微生物生产反式-4-羟基-L-脯氨酸成为可能。

国外，Shibasaki等人于2000年发表文章称已构建可以工业化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的微生物，即在含有葡萄糖和L-脯氨酸的培养基中，用大肠杆菌表达反式-4-羟基-L-脯氨酸。但是利用天然序列含有过多稀有密码子而导致目的蛋白量低，密码子优化合成基因表达量较高但是在宿主细胞中的可溶性表达低，产生较多的包涵体，不利于其工业化应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的DNA分子，所述DNA分子为将L-脯氨酸-4-羟化酶编码基因(GenBank:D78338.1)的密码子进行优化得到的DNA分子，其名称为P4HGP基因。

上述P4HGP基因的序列为序列表中序列1，序列1为将序列3的第69位的c突变为g，第72位的g突变为c得到的序列。

为解决上述技术问题，本发明还提供了含有P4HGP基因的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)含有P4HGP基因的表达盒；

B2)含有P4HGP基因的重组载体；

B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；

B4)含有P4HGP基因的重组微生物；

B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；

B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有P4HGP基因的重组细胞系；

B9)含有B1)所述表达盒的重组细胞系。