[发明专利]纳豆芽孢杆菌的发酵方法

说明书

本发明涉及一种纳豆芽孢杆菌的发酵方法，包括以下步骤：(1)液体种子培养基制备：所述液体种子培养基的配比为：糖蜜3～5g/L，黄豆粉25～35g/L，破壁酵母2～4g/L，磷酸氢二钠1～1.5g/L，磷酸二氢钠1～1.5g/L，pH调至7.0～7.5；(2)种子制备；(3)固体平板培养基的制备；(4)放大发酵；(5)收集菌泥以及(6)菌粉制备。本发明纳豆芽孢杆菌的发酵方法设备成本低，生产过程操作难度低，最终产品易提纯，加工，产生的废物废水少，原料整体的利用率高，可得到高活菌量的纳豆芽孢杆菌，且可解决在生产时(纳豆激酶)和菌体分离难的问题。

技术领域

本发明涉及微生物培养领域，特别是涉及纳豆芽孢杆菌的发酵方法。

背景技术

以纳豆芽孢杆菌发酵大豆而得的纳豆具有溶血栓、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、预防骨质疏松症以及调节肠功能等许多作用。同时纳豆芽孢杆菌还是FDA规定的43种益生菌之一以及我国农业部公布的16种可直接饲喂的微生物之一。

纳豆芽孢杆菌属细菌科、芽孢杆菌属，最早从日本传统食品“纳豆”中分离得到，是一种对人体安全的菌株。纳豆菌的原始菌株来源于枯草芽孢杆菌，因此是枯草芽孢杆菌的一个亚种纳豆芽孢杆菌菌体细胞呈杆状，两端钝圆，单生或呈短链状，可以运动，革兰氏染色呈阳性，芽孢中生，不膨大；菌落扩展、表面干燥有褶皱，呈浅白色或微带白色纳豆菌生长温度最高为45-55℃，最低为5-20℃，芽孢耐热性强，是一种很有发展前景的益生菌。

目前，纳豆芽孢杆菌高密度液态发酵工业中，普遍使用蔗糖、酵母浸出物、胰蛋白胨，氯化钠等作为基础培养基，来进行纳豆菌的发酵，从生产角度来讲存在着单位培养基产生菌体数量的浓度较低、菌液分离的成本较高等缺点；同时，液态发酵结束后的菌体提纯一般要采用冷冻干燥或喷雾干燥的方法来保证高活菌数，但由于液态发酵所含的水分很多，所以需要复杂的预除水的环节，才能进行冷冻干燥或喷雾干燥工艺，这导致了成本极高。而固态发酵目前在纳豆芽孢杆菌发酵的研究与应用还不成熟，没有比较稳定的可以生产出优质纳豆芽孢杆菌产品的工艺的相关报道，且工业发酵方法中的固体发酵还有着生产环境要求严格，生产物料消毒困难繁琐，生产过程容易污染杂菌，营养利用率低，菌体及代谢物难分离等缺点。

由于微生物发酵条件的复杂性，不同种类的微生物菌的发酵条件也存在着很大的不同，无法互相借鉴，因此，现亟需一种活菌数高的专门针对纳豆芽孢杆菌的发酵方法以及条件。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种纳豆芽孢杆菌的发酵方法。

具体技术方案如下：

一种纳豆芽孢杆菌的发酵方法，包括以下步骤：

(1)液体种子培养基制备：所述液体种子培养基的配比为：糖蜜3～5g/L，黄豆粉25～35g/L，破壁酵母2～4g/L，磷酸氢二钠1～1.5g/L，磷酸二氢钠1～1.5g/L，pH调至7.0～7.5；

(2)种子制备：先进行常规的菌种筛选及活化，然后接种于所述液体种子培养基中，在培养箱中培养，得到处于对数期的液体种子；

(3)固体平板培养基的制备：在每1L所述液体种子培养基中，加入18～32g琼脂，灭菌后倒入平板中，冷却后即可制成固体平板培养基；

(4)放大发酵：将步骤(2)中得到的液体种子均匀喷在所述固体平板培养基表面，然后放置于恒温发酵室内封闭发酵培养；

(5)收集菌泥：发酵结束后，将所述固体平板培养基取出发酵室，然后用灭菌后的薄片，将所述固体平板培养基上的菌泥刮下来，收集，得到菌泥；

(6)菌粉制备：将所述菌泥与水按质量比1:0.5～3混合，得到菌液，再将所述菌液按质量比菌液：二氧化硅＝1:1～15添加二氧化硅，进行吸附干燥，过筛，将筛上物进行粉碎后再次过筛，得到菌粉；