[发明专利]Slit2D2-嵌合抗原受体及其应用

说明书

本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)及编码所述CAR的基因，所述CAR包括能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域和胞内免疫共刺激分子，其中胞外结构域包括Slit2蛋白的D2结构域。此外，本发明还提供了一种嵌合抗体表达细胞，将编码所述CAR的基因引入细胞中，从而在细胞表面表达所述CAR。本发明所述的嵌合抗原受体或嵌合抗原受体表达细胞可作为细胞药物用于肿瘤类疾病的治疗。采用本发明嵌合抗原受体用于改造细胞尤其是T细胞，使改造后的T细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤，且具备更高效的肿瘤杀伤活性。

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗药物领域，尤其涉及Slit2D2-嵌合抗原受体在预防和/或治疗Robo1高表达肿瘤的药物中的应用。

背景技术

人体的T淋巴细胞是通过其表面的T细胞受体来识别靶细胞的，这一识别具有特异性，即某一个T淋巴细胞只识别具有特定抗原的靶细胞，而且这种特定的抗原是在细胞内加工后，在特殊分子的作用下呈递给T淋巴细胞的。这种起抗原呈递作用的分子或者存在于抗原呈递细胞表面或者存在于靶细胞表面。至少有两方面的因素导致体内的T淋巴细胞不能很好地识别癌细胞：(1)癌细胞下调抗原呈递分子的表达，(2)被呈递的抗原与T细胞受体亲和力很弱。虽然癌症患者体内存在癌细胞高度特异性的T淋巴细胞，但是数量太少起不到治疗癌症的作用。基于这种情况，科学家提出了构建嵌合T细胞受体(现在一般称为嵌合抗原受体)的概念。嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)主要由两部分构成，一端位于细胞外能够特异性识别癌细胞表面的某一抗原，另一端位于胞内含有信号激活元件(如T细胞受体的Zeta链)，起传递信号激活T细胞的作用。这样表达CAR的T淋巴细胞(CART细胞)就能避免T细胞受体识别靶细胞的限制，从而起到靶向癌细胞的杀伤作用。

目前，CART治疗的临床试验正在迅速增长，其中大部分是对B细胞恶性肿瘤治疗的评估。大多数B细胞恶性肿瘤和正常B细胞表达CD19抗原，但是其他类型的细胞没有CD19，因此CD19是一个很好的治疗靶点。不同的临床试验所采用的CD19CART细胞在组成上有一定差别，临床设计上也不一样，不过都报道了显著的效果，复发性或难治性淋巴细胞白血病的治疗能达到60-90％的反应率，一部分患者达到持续的缓解，最长的达到2年。虽然目前还不知道CD19CART治疗能达到多长时间的持续缓解，但是可以肯定的是这种免疫治疗已经给一些患者带来了以前所达不到的效果。

除了血液系统肿瘤外，研究者们一直在努力将CART治疗扩展到实体瘤。临床试验显示，GD2特异性的CART对神经母细胞瘤有一定的疗效，而aFR特异性的CART细胞对卵巢癌，CAIX特异性的CART细胞对肾细胞癌和PSMA特异性的CART细胞对前列腺癌没有显示出治疗效果。宾州大学的Carl H June等在2015年美国临床肿瘤学年会上报告了用间皮素特异性的CART细胞治疗难治的和转移的胰腺导管腺癌的结果，结果显示患者对CART细胞具有很好的耐受性，没有出现细胞因子综合征，周血中能短时期内检测到CART细胞，有2名患者病情得到稳定。因此，CART治疗实体瘤还处于早期阶段，还有许多问题需要解决。

Robo1是实体肿瘤治疗潜在新靶点，Robo是一次跨膜的受体蛋白，在哺乳动物中，已经克隆到4个Robo基因。从物种进化的角度看，Robo1，2，3的胞外部分非常的保守，从果蝇到人类都是由5个Ig样功能区和3个FibronectinIII型重复序列组成。Robos有很短的跨膜区域和一个较长的胞内区；按照序列的保守性，胞内区被划分为4个更小的区域，分别命名为：CC0，CC1，CC2，CC3。Robo4的结构与其它三个家族成员有很大的不同，它的胞外只有2个Ig样功能区和3个Fibronectin III型重复序列；胞内也只有CC0和CC2两个区域。Robos胞外的IgG domains被认为是与配体Slit结合所必需的，较长的胞内区域则和一些重要的信号分子相互作用，参与Slit/Robo下游的信号转导，从而完成刺激信号由细胞外部到内部骨架的传递。目前，已完成Slit2与Robo相互作用区域蛋白质的机构解析，发现Slit2的第二个结构域D2与Robo1的Ig1结合，进而启动信号传导。Slit2/Rono1相互作用三级结构解析参见附图1。