[发明专利]制备皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜类化合物的方法

权利要求书

1.一种制备皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜类化合物的方法，其特征在于，步骤至少包含有：

备取牛樟芝：将1-2Kg的皿培式牛樟芝放置于一萃取槽内；

萃取与分离：在操作压力2000-4000psi、温度40-60℃的操作条件下，将超临界状态溶剂以3-9L/hr流速通入该萃取槽进行萃取，超临界状态溶剂为超临界CO₂流体与乙醇以1：0.1-0.2(v/v)的体积比例混合至饱和状态，萃取30-60分钟后，将牛樟芝萃取物通入一层析管柱，利用该层析管柱将牛樟芝萃取物分离出杂质与三萜类化合物，杂质可自该层析管柱的底部去除，另自该层析管柱的顶部取出高浓度三萜类化合物；及

检测：通过细胞毒性试验、细胞形态变化分析、细胞周期、细胞凋亡检测及细胞爬行转移分析，检测三萜类化合物的抗癌效果。

2.如权利要求1所述制备皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜类化合物的方法，其特征在于，检测的步骤中，细胞毒性试验的方式，为将大肠癌细胞株放置于一96孔培养盘内200μL的完全培养基中，预定时间后将培养基置换成含三萜类化合物0.25-1.0mg/mL的完全培养基，并加入到96孔培养盘的不同孔中；另外，对照组则只加入200μL的完全培养基，培养预定时间后，以四甲基偶氮唑盐比色法分析测定每孔中的活细胞数量比值，并以免疫酵素分析仪在570nm下测定吸光值。

3.如权利要求2所述制备皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜类化合物的方法，其特征在于，为1天后将培养基置换成含三萜类化合物的完全培养基，培养2天后以四甲基偶氮唑盐比色法测定每孔中的活细胞数量比值。

4.如权利要求1所述制备皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜类化合物的方法，其特征在于，检测的步骤中，细胞形态变化分析的方式，为将大肠癌细胞株放置于一培养盘，预定时间待细胞贴底后，给予适量含有三萜类化合物1.0mg/mL的样品，并置于培养盘中预定时间后，以倒立显微镜观察细胞形态，并拍照记录。

5.如权利要求4所述制备皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜类化合物的方法，其特征在于，该培养盘为皮氏培养皿，等待细胞贴底时间为1天，而细胞贴底后给予含有三萜类化合物样品并置于培养盘的时间为2、7、14、21、28天。

6.如权利要求1所述制备皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜类化合物的方法，其特征在于，检测的步骤中，细胞周期与细胞凋亡检测的方式，为将大肠癌细 胞株经三萜类化合物1.0mg/mL处理后，以胰蛋白-乙二胺四乙酸处理细胞，与培养液一起收集，离心后去掉上清液，并以4℃磷酸盐缓冲溶液清洗后，加入1mL冰冷的75％酒精，放入4℃冰箱预定时间以固定细胞。离心后，续以1mL磷酸盐缓冲溶液悬浮，加入50mg/mL的碘化丙锭避光作用预定时间，以532nm波长激发后，在590±40nm波长侦测细胞荧光含量，以流式细胞仪进行分析。

7.如权利要求6所述制备皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜类化合物的方法，其特征在于，所述避光作用为10分钟。

8.如权利要求1所述制备皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜类化合物的方法，其特征在于，检测的步骤中，细胞爬行转移分析的方式，为将大肠癌细胞株放置于一6孔培养盘(800,000cells/well)内，培养于2mL的完全培养基，预定时间后，先用200μL滴管尖头画出一条直线，再将培养基置换成含三萜类化合物0.25-1.0mg/mL的完全培养基加到培养盘的不同孔中，并在100倍显微镜下拍照记录Day0的直线宽度。另外，对照组则只置换成2mL的完全培养基、无其他添加物，将该培养盘静置24小时，并拍照记录Day 1直线宽度密合的程度，最后以一量测软件测量每张图上任意5点的宽度变化，每个条件可得至少25个测量数据，比较Day 0与Day 1的平均数据，即可计算出细胞爬行比率。

9.如权利要求8所述制备皿培式牛樟芝中抗癌成分三萜类化合物的方法，其特征在于，将大肠癌细胞株培养于完全培养基内为1天，该量测软件为Image J软件。

10.一种抗癌成分三萜类化合物，为依据如权利要求1、2、4、6或8所述方法所制备。